Rnasaren inhibitzailea
Murine RNase inhibitzailea E.coli-tik adierazitako eta araztutako murino RNasaren inhibitzaile birkonbinatzailea da.A, B edo C RNasari 1:1 proportzioan lotzen da lotura ez-kobalentearen bidez, eta, horrela, hiru entzimen jarduera inhibitzen du eta RNA degradaziotik babesten du.Hala ere, ez da eraginkorra RNase 1, RNase T1, S1 Nuclease, RNase H edo RNase Aspergillus-en aurka.Murine RNasaren inhibitzailea RT-PCR, RT-qPCR eta IVT mRNA bidez probatu zen, eta alderantzizko transkriptasa, DNA polimerasa eta RNA polimerasa komertzialekin bateragarria zen.
Giza RNasaren inhibitzaileekin alderatuta, RNasaren inhibitzaileak ez ditu oxidazioarekiko oso sentikorrak diren bi zisteinarik eta horrek inhibitzailea inaktibatzea eragiten du.Horrek DTT-ko kontzentrazio baxuetan egonkorra egiten du (1 mM baino gutxiago).Ezaugarri honi esker, DTT-ren kontzentrazio handiak erreakziorako kaltegarriak diren erreakzioetan erabiltzeko egokia da (adibidez, denbora errealeko RT-PCR).
Aaplikazioa
Produktu hau oso erabilia izan daiteke RNAsaren interferentzia posible den edozein esperimentutan RNA degradazioa saihesteko, hala nola:
1.cDNAren lehen katearen sintesia, RT-PCR, RT-qPCR, etab.
2.RNA in vitro transkripzioan/itzultzean (adibidez, in vitro birusaren erreplikazio-sistema) degradaziotik babesten du.
3.RNAsaren aktibitatearen inhibizioa RNA bereiztean eta arazketan.
Biltegiratzeko baldintzak
Produktua -25~- 15 ℃-tan gorde daiteke, 2 urterako balio duena.
Biltegiratze buffer
50 mM KCl, 20 mM HEPES-KOH (pH 7,6, 25 ℃), 8 mM DTT eta % 50 glizerola.
Unitatearen definizioa
A erribonukleasaren 5ng-ren jarduera % 50ean inhibitzeko behar den RNasaren inhibitzaile murineko kopurua unitate bat (U) gisa definitu zen.
Proteinaren pisu molekularra
Hilerriaren RNasaren inhibitzailearen pisu molekularra 50 kDa da.
Kalitate kontrola
Exonukleasa Jarduera:
1 μg λ-Hind III-k 37 ℃-tan 16 orduz digeritzen dituen RNasaren inhibitzaile murineko 40 U-k ez du degradaziorik ematen agarosa gelaren elektroforesiaren arabera.
Endonukleasaren jarduera:
Agarosa gel elektroforesiaren bidez zehazten den 1 μ g λ DNA duten 40 U 37 ℃-tan 16 orduz ez dute degradaziorik ematen.
Nicking Jarduera:
1 μ g pBR322-rekin 16 orduz 37 ℃-tan dagoen RNasaren inhibitzaile 40U-k ez du degradaziorik ematen agarosa gelaren elektroforesiaren arabera.
RNasa Jarduera:
Agarosa gel elektroforesiaren bidez zehazten den 40 U 37 ℃-tan 40 U-k 1,6 μ g MS2 RNA dituen RNasaren inhibitzaileak ez du degradaziorik ematen.
E.coli DNA:
Murine RNasaren inhibitzaileen 40 U E. coli DNA genomikoaren presentzia aztertzen da TaqMan qPCR erabiliz, E. coli 16S rRNA locuserako abiarazle espezifikoak dituztenekin.E. coli DNA genomikoaren kutsadura ≤ 0,1 pg/40 U da.
Notes
1.Oszilazio bortitzak edo nahasteak entzimak desaktibatzea ekarriko du.
2.Inhibitzaile honen tenperatura-tarte optimoa 25-55 ℃ zen, eta 65 ℃ edo gehiagotan desaktibatu zen.
3. RNasa H, RNasa 1 eta RNasa T1-en jarduerak ez zituen RNasa-inhibitzaileak murineko inhibitzaileak inhibitu.
4.RNasaren jardueraren inhibizioa pH sorta zabalean aurkitu zen (pH 5-9 guztiak aktiboak ziren), eta jarduera handiena pH 7-8an ikusi zen.
5. Erribonukleasek normalean desnaturalizazio-baldintzetan jarduera mantentzen dutenez, kontuz ibili behar da erribonukleasa batekin konplexatutako RNasaren inhibitzaileen molekula desnaturalizatzea saihesteko.Erribonukleasa aktiboa askatzea saihesteko, saihestu behar dira 50 °C-tik gorako tenperaturak eta urea edo beste agente desnaturalizatzaileen kontzentrazio handiak.
