Proteinasa K (hauts liofilizatua)
Katuaren zenbakia: HC4500A
K proteinasa serina proteasa egonkorra da, substratuaren espezifikotasun handia duena.Jatorrizko egoeran proteina asko degradatzen ditu detergenteen presentzian ere.Kristalen eta egitura molekularren ikerketen frogak adierazten du entzima subtilisinaren familiakoa dela, gune aktiboko hirukote katalitiko batekin (Asp39-Haren69- Ser224).Zatiketa gune nagusiena alfa amino talde blokeatuak dituzten aminoazido alifatiko eta aromatikoen karboxilo taldearen ondoan dagoen lotura peptidikoa da.Bere zabalerako erabiltzen da normaleanespezifikotasuna.
Biltegiratzeko baldintzak
2-8 ℃ epe laburreko biltegiratzea, -25 ~ -15 ℃ epe luzerako biltegiratzea.Hauts lehorren egoera -25 ~ -15 ℃ 3 urterako balio du;entzimaren hautsa bolumen egokian disolbatu behar da.
Zehaztapena
| Itxura | Hauts liofilizatu amorfo zuritik zuritik |
| Jarduera | ≥30 U/mg |
| DNasa | Ez da bat ere detektatu |
| RNasa | Ez da bat ere detektatu |
Propietateak
| EC zenbakia | 3.4.21.64 (Tritirachium albumeko birkonbinatzailea) |
| Pisu molekularra | 29 kDa (SDS-PAGE) |
| Puntu isoelektrikoa | 7.81 |
| pH optimoa | 7,0-12,0 1. irudia |
| Tenperatura optimoa | 65 ℃ 2. irudia |
| pH-aren egonkortasuna | pH 4,5-12,5 (25℃, 16h) 3. irudia |
| Egonkortasun termikoa | 50℃-tik behera (pH 8,0, 30min) 4. irudia |
| Aktibatzaileak | SDS, urea |
| Inhibitzaileak | Diisopropil fluorofosfatoa;fenilmetilsulfonil fluoruroa |
Aplikazioak
1. Diagnostiko genetikoa egiteko kit
2. RNA eta DNA erauzteko kitak
3. Ehunetatik proteinak ez diren osagaiak erauztea, proteina-ezpurutasunak degradatzea, hala nola DNAren txertoak eta heparina prestatzea.
4. ADN kromosomaren prestaketa pultsatuko elektroforesiaren bidez
5. Western blot
6. Albumina glikosilatuen erreaktibo entzimatikoak in vitro diagnostikoa
Neurriak
Erabili edo pisatzen duzunean babes eskularruak eta betaurrekoak erabili, eta ondo aireztatuta erabili ondoren.Produktu honek larruazaleko erreakzio alergikoak eta begietako narritadura larriak sor ditzake.Arnastuz gero, alergia edo asma sintomak edo disnea sor ditzake.Arnas narritadura eragin dezake.
Saiakera
Unitatearen definizioa
Unitate bat (U) honela definitzen da: kaseina hidrolizatzeko behar den entzima kantitatea minutuko 1 μmol tirosina ekoizteko baldintza hauetan.
Erreaktiboak prestatzea
I erreaktiboa: 1 g esne kaseina 0,1 M sodio fosfato disoluzioko 50 ml-tan disolbatu zen (pH 8,0), 65-70 ℃ uretan inkubatu 15 minutuz, irabiatu eta disolbatu, urez hoztu, sodio hidroxidoarekin 8,0 pH-ra egokitu eta bolumen finkatua. 100ml.
II erreaktiboa: 0.1M azido trikloroacetikoa, 0.2M sodio azetatoa, 0.3M azido azetikoa.
III erreaktiboa: 0,4M Na2CO3irtenbidea.
IV erreaktiboa: forint erreaktiboa ur puruz diluitua 5 aldiz.
V erreaktiboa: entzimaren diluitzailea: 0,1M sodio fosfato disoluzioa (pH 8,0).
VI erreaktiboa: tirosina-disoluzioa: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol/ml 0,2M HCL-rekin disolbatutako tirosina.
Prozedura
1. 0,5 ml I erreaktiboa aurrez berotzen da 37 ℃-ra, gehitu 0,5 ml entzima-soluzio, ondo nahastu eta 37 ℃-tan inkubatu 10 minutuz.
2. Gehitu 1 ml erreaktibo II erreakzioa gelditzeko, ondo nahastu eta inkubazioa jarraitu 30min.
3. Zentrifugatu erreakzio-disoluzioa.
4. Hartu 0,5 ml gainditzailea, gehitu 2,5 ml III erreaktiboa, 0,5 ml IV erreaktiboa, ondo nahastu eta inkubatu 37 ℃-tan 30 minutuz.
5. OD660OD gisa zehaztu zen1;kontrol talde hutsa: 0,5 ml V erreaktiboa erabiltzen da entzimaren soluzioa ordezkatzeko OD zehazteko660OD bezala2, ΔOD=OD1-OD2.
6. L-tirosina kurba estandarra: 0,5 ml-ko kontzentrazio desberdina L tirosina-disoluzioa, 2,5 ml erreaktiboa III, 0,5 ml IV erreaktiboa 5 ml zentrifuga-hodi batean, inkubatu 37 ℃-tan 30 minutuz, detektatu OD.660L-tirosinaren kontzentrazio desberdinetarako, ondoren Y=kX+b kurba estandarra lortu da, non Y L-tirosinaren kontzentrazioa den, X OD den600.
Kalkulua
2: erreakzio-disoluzioaren bolumen osoa (mL)
0,5: entzimaren disoluzioaren bolumena (mL)
0,5: determinazio kromogenikoan erabilitako erreakzio likidoaren bolumena (mL)
10: Erreakzio denbora (min)
Df: Diluzio anitza
C: Entzimaren kontzentrazioa (mg/mL)
Erreferentziak
1. Wieger U & Hilz H. FEBS Lett.(1972);23:77.
2. Wieger U & Hilz H. Biochem.Biofisikoa.Erres.Komunik.(1971);44:513.
3. Hilz, H.et al.,Euro.J. Biokimika.(1975);56:103–108.
4. Sambrook Jet al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. edizioa, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor (1989).
2. irudia Tenperatura optimoa
Erreakzioa 20 mM K-fosfato tamponean pH 8,0.Entzimaren kontzentrazioa: 1 mg/mL
3. irudia pH Egonkortasuna
25 ℃, 16 h-tratamendua 50mM buffer soluzioarekin: pH 4,5-5,5, azetatoa;pH 6,0-8,0, Na-fosfatoa;pH 8,0-9,0, Tris-HCL.pH 9,0-12,5, Glizina-NaOH.Entzimaren kontzentrazioa: 1 mg/mL
4. irudia Termikoa egonkortasuna
30 minutuko tratamendua 50 mM Tris-HCL tamponarekin, pH 8,0.Entzimaren kontzentrazioa: 1 mg/mL
5. irudia Biltegiratzea egonkorraty at 25℃
