
Fast Ampli RT-qPCR Premix plus-UNG
Katuaren zenbakia: HCB5144E
Fast Ampli RT-qPCR Premix plus-UNG liofilizazio prozesuetarako bereziki garatu da, fluoreszentzia kuantifikatzeko (TaqMan zunda) RNA anplifikazioa detektatzeko neoscript alderantzizko transkriptasa eta anplifikazio azkarreko DNA polimerasa genetikoki eraldatuta eta PCR anplifikazioa 20 barruan osa dezakeen baheketa. -40 minutu.Erreaktibo honek inhibitzaile-tolerantzia handia du, alderantzizko transkripzioa eta PCR anplifikazio-eraginkortasun handiagoa duena, kontzentrazio baxuko RNA laginen sentsibilitate handiko anplifikaziorako egokia.Kurba estandar on bat lor daiteke sorta kuantitatibo zabal baten barruan, eta kuantifikazioa zehaztasunez egin daiteke.Erreaktibo honek inhibizioaren aurkako anplifikazio entzimaren eta UNG entzimaren entzima misto bat erabiltzen du, baita dUTP duen buffer sistema optimizatu bat ere.Inhibitzaileak dituzten laginetan xede genearen anplifikazio ona lortzeaz gain, PCR hondar eta aerosolen kutsadurak eragindako anplifikazio positibo faltsuak modu eraginkorrean saihesten ditu.Erreaktibo hau PCR kuantitatibo fluoreszente gehienekin bateragarria da, hala nola Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad, Roche eta abarrekin.Erreaktibo hau liofilizaziorako erabil daiteke forma liofilizatu ona eta produktuaren egonkortasuna lortzeko.
Erreaktiboen konposizioa
1. 12,5×FastAmpli Part Taq/UNG Mix (dNTPekin) (DG)
2. 50× FastAmpli Part RTase (DG)
3. 5 ×FastAmpliRT Buffer (DG)
4. 4 ×lyoprotectant (aukerakoa) (DG)
Biltegiratzeko baldintzak
-20 ℃-tan gorde daiteke epe luzerako, 4 ℃-tan 3 hilabetez.Ondo nahastu erabili aurretik eta saihestumaiz izoztu-desizoztea.
Bizikleta Protokoloa
Urratsa |
Tenperatura | PCR erregularra Prozedura | PCR azkarraProzedura |
Zikloak |
Iraupena | Iraupena | |||
AlderantzizTranskripzioa | 50℃ | 15 min | 5 min | eutsi |
PolimerasaAktibazioa | 95℃ | 1-5 min | 1-2 min | eutsi |
Desnaturalizatzea | 95℃ | 10-20 s | 1-3 seg | 40-50 |
Errekostea/Luzapena | 56-64 ℃ | 20-60 s | 3-20 seg |
RT-qPCR likido erreakzioaioi-sistema
Konposizioa | 25µl Bolumena | 50µL Bolumena | Kontzentrazioa |
5 × FastAmpli RT Buffer | 5µl | 10µL | 1× |
12,5×FastAmpli Part Taq/UNG Mix (dNTPekin) | 2µl | 4µl | 1× |
50× FastAmpli Part RTase | 0,5 µL | 1µL | 1× |
4 × lioprotektorea | 6,25 µL | 12,5 µL | 1× |
25×Primer-Probe Mix | 1µL | 2µl | 1× |
RNA txantiloia | — | — | — |
ddH2O | 25 µL-tara | 50 µL-tara | 1× |
1. Sistema hau liofilizazio sistema bat da;Bezeroek sistema hau liofilizazio-baldintzarik gabe erabiltzen dutenean, 4×lyoprotectant gehi daiteke selektiboki;Produktu liofilizatuak behar badira, erreaktibo likidoen faseko produktuaren errendimenduaren baliozkotzean, 4 × lioprotektore gehitu behar ditu sistema liofilizatuen osagai eta efektuekin koherentzia bermatzeko.
2. PCR prozedura arrunta erabiltzen denean, primeraren azken kontzentrazioa 0,2μM izan ohi da.Emaitza hobeak lortzeko, lehen kontzentrazioa optimizatu daiteke 0,2-1,0μM bitarteko tartean.Zundaren kontzentrazioa 0,1-0,3μM bitarteko tartean optimizatu daiteke.Kontzentrazio-gradienteko esperimentuak egin daitezke abiarazleen eta zunden konbinazio onena aurkitzeko.
3. PCR anplifikazio metodo azkarra erabiltzean, emaitza hobea lor daiteke primer/zundaren kontzentrazioa handituz, baita primer eta zundaren portzentajea egokituz ere.
4. Txantiloi mota ezberdinek xede-genearen kopia-kopuru desberdinak dituzte.Gradiente-diluzio bat egin daiteke txantiloi gehigarri optimoen kantitate egokia hautatzeko, beharrezkoa bada.
Liofilizazio sistemaren prestaketa
Konposizioa | 25µL Erreakzioa Sistema |
5 × FastAmpli RT Buffer | 5µl |
12,5 × FastAmpli Part Taq/UNG Mix (dNTPekin) (DG) | 2µl |
50 × FastAmpli Part RTase (DG) | 0,5 µL |
4×Lioprotektorea | 6,25 µL |
25×Primer-Probe Mix | 1µL |
ddH2O | 18 ~ 20 µL-ra |
* Liofilizaziorako beste sistema batzuk behar badira, mesedez kontsultatu aparte.
Liofilizazio Proces
Prozedura | Tenperatura. | Denbora | Baldintza | Presioa |
Izoztea | 4℃ | 30 min | Eutsi | 1 atm |
-50℃ | 60 min | Hoztea | ||
-50℃ | 180 min | Eutsi | ||
Lehen Lehorketa | -30℃ | 60 min | Berokuntza | Azken hutsunea |
-30℃ | 720 min | Eutsi | ||
Bigarren mailako lehorketa | 25℃ | 60 min | Berokuntza | Azken hutsunea |
25℃ | 300 min | Eutsi |
1. Liofilizazio-prozesu hau 25µL-ko erreakzio-sistema baten in situ liofilizazio-prozesu bat da;liozitzeko aleak edo in situ liofilatzeko beste prozesu batzuk behar badira, mesedez galdetu bereizita.
2. Goiko liofilizazio prozesua erreferentziarako soilik da.Produktu mota ezberdinek eta izozgailu desberdinek parametro desberdinak dituzte, erabileran zehar benetako baldintzen arabera doikuntzak egin daitezke.
3. Liofilizazio-prozesu desberdinak egokiak izan daitezke produktu liofilizatuen loteen tamaina desberdinetarako, beraz, eskala handiko produkziorako erabiltzen direnean probaren baliozkotze nahikoa egin behar da.
Liofiliza erabiltzeko jarraibideaked hauts
1. Laburki zentrifugatu hauts liofilizatua;
2. Gehitu azido nukleikoen txantiloia hauts liofilizatuari eta gehitu ura 25µL arte;
3. Ondo nahastu zentrifugazio bidez eta exekutatu makinan.
Kalitate kontrola
1. Saiakuntza funtzionalak: RT-qPCRren sentsibilitatea, espezifikotasuna, erreproduzigarritasuna.
2. Nukleasa-jarduera exogenorik, ez endo/exonukleasa-kutsadura exogenorik.
Informazio teknikoa:
1. DNA polimerasa azkarren anplifikazio-tasa ez da 1 kb/10s baino txikiagoa.PCR tresna ezberdinek berotze- eta hozte-abiadura, tenperatura kontrolatzeko moduak eta eroankortasun termikoa dituzte, beraz, zure lehen/zunda-kontzentrazioa eta exekuzio-metodoa optimizatzea ezinbestekoa da zure PCR tresna azkar espezifikoarekin konbinatuta.
2. Alderantzizko transkripzio-denbora anplifikatu beharreko zatiaren luzeraren arabera optimizatzen da.Zati luzeagoetarako, alderantzizko transkripzio-denbora egoki luzatu daiteke.
3. Annealing-en luzapen-tenperatura optimizatu behar da primer-zundaren Tm balioaren eta erreakzioaren benetako baldintzen arabera.
4. Errekuzimendu-tenperatura baxuagoko edo 200 bp zati baino luzeagoak dituzten lehengaietarako, 3 urratseko metodoa gomendatzen da.
5. Mesedez, erabili eremu eta pipetak dedikatuak anplifikazioa baino lehen eta ondoren, eskularruak jantzi eta maiz aldatu;ez ireki erreakzio-hodia PCR erreakzioa amaitu ondoren, PCR produktuek laginak kutsatzea minimizatzeko.
6. DUTP-ren erabilera-eraginkortasuna eta UNG entzimarekiko sentikortasuna desberdinak dira xede-gene desberdinetarako, beraz, UNG sistema erabiltzeak detekzio-sentsibilitatea gutxitzen badu, erreakzio-sistema egokitu eta optimizatu behar da.Laguntza teknikoa behar izanez gero, jar zaitez gurekin harremanetan.