Hotstart Taq DNA Polimerasa
Hot Start Taq DNA Polymerase (Antigorputzaren aldaketa) Thermus aquaticus YT-1-eko DNA polimerasa termoegonkorra da, 5′→3′ jarduera eta 5′ flap endonukleasa jarduera dituena.Hasiera beroko Taq DNA polimerasa Taq DNA polimerasa bat da, Taq antigorputz termolabilez eraldatua.Antigorputzen aldaketak PCRren espezifikotasuna, sentsibilitatea eta etekina areagotu zituen.
Osagaiak
| Osagaia | HC1012A-01 | HC1012A-02 | HC1012A-03 | HC1012A-04 |
| 5×HC Taq Buffer | 4 × 1 ml | 4 × 10 ml | 4 × 50 ml | 5×400 ml |
| Hot Start Taq DNA polimerasa (antigorputz aldatua) (5 U/μL) | 0,1 ml | 1 ml | 5 ml | 10 × 5 ml |
Aplikazioak
10 mM Tris-HCl (pH 7,4 25 ℃-tan), 100 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 1 mM ditiotreitol, % 0,5 Tween20, % 0,5 IGEPALCA-630 eta % 50 Glizerola.
Biltegiratze-baldintza
Garraioa 0°C-tik behera eta -25°C~-15°C-tan gorde.
Unitatearen definizioa
Unitate bat 30 minututan 75 °C-tan 15 nmol dNTP material azido disolbaezin batean sartzen duen entzima-kantitatea bezala definitzen da.
Kalitate kontrola
1.Endonukleasa Jarduera:20 U entzimaren inkubazioak 4 μg pUC19 DNArekin 4 orduz 37 ℃-tan ez zuen DNAren degradazio hautemangarririk izan gel elektroforesiaren bidez zehaztutako moduan.
2.5 kb Lambda PCR:5 ng Lambda DNAren PCR anplifikazioaren 25 ziklok Taq DNA Polimerasaren 1,25 unitaterekin 200 µM dNTP eta 0,2 µM abiarazpenen aurrean espero zen 5 kb-ko produktua lortzen da.
3.Exonukleasaren jarduera:Taq DNA polimerasa 10 nmol 5´-FAM oligonukleotidoarekin gutxienez 12,5 U dituen 50 µl-ko erreakzio baten inkubazioak 37 ℃-tan 30 minutuz ez du degradazio detektagarririk ematen.
4.RNasaren jarduera:20 U entzima dituen 10 µL erreakzioaren inkubazioak 1 µg RNA transkripzioarekin 2 orduz 37 °C-tan RNAren degradazio hautemangarririk ez da izan gel elektroforesiaren arabera.
5.Beroaren desaktibazioa:Ez.
Erreakzio-sistema
| Osagaiak | Bolumena |
| DNA txantiloiaa | aukerakoa |
| 10 μM Forward Primer | 0,5 μL |
| 10 μM Alderantzizko Primer | 0,5 μL |
| dNTP nahasketa (10 mM bakoitza) | 0,5 μL |
| 5×HC Taq Buffer | 5 μL |
| Taq DNA Polimerasab(5U/μL) | 0,125 μL |
| Nukleasarik gabeko ura | Gehienez 25 μL |
Oharrak:
1) a.
| DNA | Zenbatekoa |
| Genomikoa | 1 ng-1 μg |
| Plasmidoa edo Birala | 1 pg-1 ng |
2) b.Taq DNA Polimerasaren kontzentrazio optimoa 5-50 unitate/mL bitartekoa izan daiteke (0,1-0,5 unitate/25 µL erreakzioa) aplikazio espezializatuetan.
Bizikleta termikorako protokoloa
PCR
| Urratsa | Tenperatura(°C) | Denbora | Zikloak |
| Hasierako desnaturalizazioaa | 95 ℃ | 1-3min | - |
| Desnaturalizazioa | 95 ℃ | 15-30 s | 30-35 Zikloak |
| Ontzeab | 45-68 ℃ | 15-60 s | |
| Luzapena | 68 ℃ | 1 kb/min | |
| Azken Luzapena | 68 ℃ | 5min | - |
Oharrak:
1) 95 °C-tan 1 minutuko hasierako desnaturalizazioa nahikoa da anplifikazio gehienetarako.Txantiloi zailetarako, 2-3 minutuko desnaturalizazio luzeagoa 95 °C-tan gomendatzen da.Koloniako PCRarekin, hasierako 5 minutuko desnaturalizazioa 95 °C-tan gomendatzen da.
2) Errekuzitzeko urratsa 15-60 s-koa izan ohi da.Erretiro-tenperatura primer bikotearen Tm-an oinarritzen da eta normalean 45-68 ℃ da.
