T7 RNA polimerasa
T7 RNA polimerasa T7 fagoko DNAren menpeko RNA polimerasa da, 5´→ 3´ RNA polimerasaren jarduera indartsu eta espezifikoa duena. sustatzaile batetik behera txertatuta.
Osagaiak
T7 RNA polimerasa (50 U/μL)
10×HH T7 Buffer
Biltegiratzeko baldintzak
Garraioa 0 °C-tik behera eta biltegiratzea -25 ~ - 15 °C-tan.
Zehaztapena
| produktuaren izena | T7 RNA polimerasa |
| Produktuen karakterizazioa | Likido garbia |
|
Jarduera-unitatearen definizioa | Unitate bat entzima kantitatea bezala definitzen da horrek NTP katalizatuko du 1 nmol PPi ekoizteko Ordu 1 37 °C-tan erreakzio-sistema estandarrean. |
| Biltegiratze buffer | 50 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 20 mM β-M, 1 mM EDTA, % 50 Glizerola ,0.% 1 (p/g) Triton® X- 100, pH 7,9 @ 25 °C. |
|
10×HH T7 buffer | 400 mM Tris-HCl (25 ℃, pH 8,20), 60 mM MgCl2, 100 mM DTT, 20 mM espermidina. |
| Biltegiratze-egoera | -25 ~ - 15 ℃, saihestu behin eta berriz izozte-desizoztea |
Erreakzioa eta Baldintza
Ohiko erreakzioa
| Erreaktiboa | Zenbatekoa |
| Nukleasarik gabeko H2O edo DEPCz tratatutako ura | Gehienez 20 μL |
| 10×HH T7 Buffer | 2 μL |
| ATP/GTP/CTP/UTP (100 mM bakoitza) | 0,4 μL bakoitza (2 mMeach finala) |
| RNasaren inhibitzailea (40 U/μL) (aukerakoa) | 1 μL (40 U) |
| Pirofosfatasa ez-organikoa (aukerakoa) | 0,5 μL (0,05U) |
| T7 RNA polimerasa (50 U/μL) | 1 μL |
| ADN linealizatuaren txantiloia | 1 μg |
Gehitu erreakzio-osagaiak goiko ordenan * 10 × HH T7 Buffer 2 mM NTPetarako soilik egokia da, errendimendu handiko T7 transkripzio-kit batzuk 7,5 mM- 10 mM NTPetarako gomendatzen dira.
Inkubazio denbora:37 °C 2 orduz.
Stop Erreakzioa: Gehitu 2μL 0,2 M EDTA (pH8.0@25℃) edo berotu 75 °C-ra 10min.
DNA kentzea: DNA txantiloia 2U DNasa I (RNasarik gabekoa) kendu daiteke eta 15 minutuz 37 °-tan inkubatu.
Kalitate kontrola
•Endonukleasen jarduera: 1 μg λDNArekin 1 μg λDNArekin 50 μL-ko erreakzio baten inkubazioak 37 ℃-tan ez du degradazio detektagarririk eragiten.
•Exonukleasaren jarduera: 50 μL-ko erreakzio baten inkubazioak 1 μg λ -Hind Ⅲ DNA digeritzen duen T7 RNA polimerasa gutxienez 50U dituena 16 orduz 37 ℃-tan ez da detekta daitekeen degradazioa eragiten.
•Nickase Jarduera: 50 μL-ko erreakzio baten inkubazioak 1 μg pBR322 DNArekin 1 μg pBR322 DNArekin gutxienez 50U dituen 50 μL-ko erreakzioa 37 °C-tan ez da detekta daitekeen degradaziorik eragiten.
•RNasa Jarduera: 50μL-ko erreakzio bat gutxienez 50U T7 RNA polimerasa 1,6μg MS2 RNArekin 37 °C-tan 16 orduz inkubatzeak ez du degradazio detektagarririk eragiten zehaztu bezala.
•Beroaren desaktibazioa: 75 °C 10 min.
Zuhurtzia
• Transkripzio-erreakzioa RNasen kutsadurarik gabeko ingurune batean egin behar da.Eskularruak erabiltzea komeni da.Puntak, hodiak eta urak nukleasarik gabekoak izan behar dute.
• RNAren produkzio-etekina hobetu daiteke NTPren kontzentrazioa handituz (kontzentrazio bakoitza 10mMra irits daiteke), eta Mg2+ kontzentrazioa behar bezala handitu behar da.
• RNA sintesi erreakzio-nahasketa giro-tenperaturan prestatu behar da, izan ere, 10×HH T7 Bufferren aurrean DNA hauspea daiteke 4°C-tan.
•Luzera egokiko transkripzioen etekina gutxitzen da txantiloia DNA guztiz linealizatuta badago.•Erreakzio-nahastea gora edo behera egin daiteke.• Erreakzio-produktuaren etekina murrizten bada, 20 mM DTT freskoa gehi dakioke erreakzio-sistemari.
• Transkribatutako zatiak 500bp baino txikiagoak edo berdinak dira, eta transkripzio-denbora 4-8 ordura luzatzea gomendatzen da.
•Prezipitatuak erraz aurki daitezke 10×HH T7-n.
