
Rnasa saiakuntzako kit (fluoreszentzia)
RNasa detektatzeko kit fluoroforoz markatutako RNA zunda batean oinarritzen da.Laginak RNasaren jarduerarik ez duenean, zunda egonkorra da eta ez du seinale fluoreszenterik sortzen;laginak RNasaren jarduera daukanean, zunda degradatu egiten da, eta ondorioz, pixkanaka-pixkanaka fluoreszentzia-seinalea hobetzen da;fluoreszentzia-seinalearen hazkunde-tasa positiboki erlazionatuta dago entzimen kopuruarekin eta jarduerarekin.Erabili fluoreszentzia mikroplaken irakurgailu bat ex/em=535/575nm uhin-luzeran neurtzeko lagina RNasak kutsatuta dagoen zehazteko.
Aplikazio
Kit hau laginetan RNasaren kutsadura detektatzeko erabiltzen da.
Caurkariak
Izena | HCP0035A-01 (192T) | HCP0035A-02 (48T) |
10 × erreakzio-disoluzioa | 2,0 ml | 0,5 ml |
RNA zunda | 1 hodi | 1 hodi |
TE buffer | 2,0 ml | 0,5 ml |
RNasa A estandarra (10 mg/ml) | 20μL | 10μL |
Diluzio Buffer Estandarra | 12 ml | 6 ml |
DNasa&RNasarik gabeko ura | 25 ml | 25 ml |
DNase RNase kanpoan | 50 ml | 50 ml |
Biltegiratzea eta egonkortasuna
1. -25 ~ - 15 ℃-tan garraiatu;
2.Kitaren osagai desberdinak bereizita gordetzen dira tenperaturaren arabera:
Izena | tenperatura |
10 × erreakzio-disoluzioa | -25 ~ -15 ℃ |
RNA zunda | -25 ~ -15 ℃ |
TE buffer | -25 ~ -15 ℃ |
RNasa A estandarra (10 mg/ml) | -25 ~ -15 ℃ |
Diluzio Buffer Estandarra | -25 ~ -15 ℃ |
DNasa&RNasarik gabeko ura | -25 ~ 30 ℃ |
DNase RNase kanpoan | 2 ~ 30 ℃ |
3. Gorde ezazu ireki gabeko kita 12 hilabetez.
4.Gorde kit-a ireki eta gero 6 hilabetez.Gomendatzen da RNA zunda disoluzioa erabilera bakarreko kantitatearen arabera egitea, argia eta behin eta berriz izoztea eta desizoztea ekiditeko.
Beharrezko ekipoak eta kontsumigarriak
1.Fluoreszentzia mikroplaken irakurgailua (ex/em=535/575nm uhin-luzera barne)
2. DNase&RNasarik gabeko pipetak eta puntak
3. DNasa eta RNasarik gabeko EP hodia
4. DNasa eta RNasarik gabeko 96 putzuko plaka beltz ez gardena
Erreaktiboak prestatzea
1.Atera kita eta orekatu giro-tenperaturan (18 ~ 25 ℃), astindu eta nahastu osagaiak, hala nola, 10× erreakzio-soluzioa, TE buffer, RNasa A estandarra (10mg/mL), Standard Dilution Buffer, eta ondoren zentrifugatu berehala.(Zentrifugatu 4000~7000rpm-ra 10 segundoz).
2. Zentrifugatu RNA zunda 4000 ~ 7000 rpm-tan 60 segundoz hodiaren behealdera biltzeko, ireki hodi-tapa kontu handiz, eta gehitu 40μL TE buffer RNA zunda biltegiratzeko soluzio gisa disolbatzeko, RNA zunda biltegiratzeko soluzio alikuotaren arabera. erabilera bakarreko kopurura eta gorde -25 ~ -15 °C-tan behin eta berriz izoztea eta desizoztea saihesteko.Atera zunda biltegiratzeko soluzioa proba egiten duzun bakoitzean, diluitu 50 aldiz TE bufferarekin (adibidez, gehitu 490μL TE buffer 12μL RNA zunda batean) RNA zunda lan egiteko irtenbide gisa.Gorde RNA zunda funtzionatzen duen soluzioa -25 ~ -15 °C-tan, argia eta behin eta berriz izoztea eta desizoztea ekiditeko.
Detektatzeko urratsak
1. Lehenengo probaren aurretik irabazi egokia ezartzeko urratsa, sentsibilitatea galtzeko edo seinalearen gainsaturazio arriskua ekiditeko.
1) Tresnen parametroak:
Plaka astindu 10 ~ 15 s detektatu aurretik;
Kitzikapen-uhin-luzera λEx=535nm;
Igorpen-uhin-luzera λEm=575nm;
Erabili irabazi automatikoaren funtzioa;
Tenperatura 37 ℃;
Amaierako modua.
Ezarri irabazia eskala automatikoan, ahal izanez gero, bestela, hasieran irabazi ertaineko ezarpena erabili.
Oharra: tresna ezberdinen ezarpen metodoa ez da koherentea, mesedez kontsultatu tresna hornitzaileari xehetasunak lortzeko.
2) Hautatu 2 putzu 96 putzuko plakan, gehitu 10μL RNA zunda lan-disoluzioa eta 10μL 10×erreakzio-soluzioa putzu bakoitzean;
3) Gehitu 80μL DNasa eta RNasarik gabeko ur putzu batera, eta gehitu 79μL DNasa eta RNasarik gabeko ur eta 1μL RNasa A estandarra (100mg/mL) beste putzuan.
4) Jarri plaka leku ilun batean 37 °C-tan eta probatu 30 minuturen buruan.
5) Irabazia autoscalean ezarriz gero, Gain balioa datu-fitxategiko tresna-parametroen barran bistaratuko da, G1 gisa adierazita.
6) Hasieran irabazi ertaineko ezarpena erabiltzean, kontuan izan behar da: fluoreszentzia handiko balioak tresnaren goiko muga gainditzen badu, irabaziaren balioa behar bezala murriztu behar da;fluoreszentzia-balio altua tresnaren goiko mugatik urrun badago, irabazi-balioa behar bezala handitu beharko litzateke;Azkenik, irabazi-balio egokia lortzen da, G2 bezala adierazita.
2. Seta tresnaren parametroak:
Plaka astindu 10 ~ 15 s detektatu aurretik;
Kitzikapen-uhin-luzera λEx=485nm;
Igorpen-uhin-luzera λEm=525nm;
Ezarri irabaziaren balioa G1 edo G2 got 1 urratsean;
Tenperatura 37 ℃;
Mikroplaken irakurgailuak modu zinetikoa onartzen badu, detekzio zinetikoa erabiltzea gomendatzen da, 1 eta 1,5 minutu arteko tartearekin, eta denbora osoa 30 minutukoa da.
3.Laginak prestatzea
Gomendatutako laginaren bolumena 80μL da.Probatu beharreko lagina 80μL baino txikiagoa bada, diluitu 80μL-ra DNasa eta RNasarik gabeko urarekin.
Probatu beharreko laginak fluoroforoaren luminiszentzia eragiten duten substantziak dituenean (adibidez, disoluzio ilunak, kontzentrazio handiko substantzia likatsuak edo surfaktanteak), lagina DNasa eta RNasarik gabeko urarekin diluitu behar da, baina kontuan izan diluzio-eragiketak eragina izango duela. sentikortasuna.RNasaren jarduera inhibitzaileak dituen laginarentzat (adibidez, indar ioniko handiko disoluzioak, pH<4 edo pH>9 tamponak, proteina desnaturalizatzaileak, etab.), neurketaren emaitza laginaren disoluzioaren entzimaren jarduera orokorra da, ez. entzimaren jarduera indibiduala.
Diluitu DNasa I estandarra (10 mg/mL) Diluzio Buffer Estandar batekin, honela:
Ez. | prestatzeko prozesua | Kontzentrazioa |
1 | 2μL RNasa A estandarra + 198μL Estandar Diluzio Buffer | 0. 1mg/mL |
2 | 2μL N. 1 lagina + 198μL Diluzio Buffer Estandarra | 1 × 10-3 mg/mL |
3 | 2μL 2. zenbakia + 198μL Diluzio Buffer Estandarra | 1 × 10-5 mg/mL |
4 | 2μL 3. zenbakiko lagina + 198μLdiluzio-buffer estandarra | 1 × 10-7 mg/mL |
5 | 100μL 4. zenbakia + 100μL Diluzio Buffer Estandarra | 5 × 10-8 mg/mL |
Diluitu 5. zenbakia DNasa eta RNasarik gabeko urarekin 10 aldiz:
6 | 20μL 5. zenbakia + 180μL DNasa eta RNasarik gabeko ura | 5 × 10-9 mg/mL, 5 pg/ml |
6. zenbakia kontrol positibo gisa erabiltzen da;DNasa eta RNasarik gabeko ura kontrol negatibo gisa erabiltzen da.
4.Dosifikazioa eta probak
1) Gehitu 10μL RNA zunda lan-disoluzioa eta 10μL 10× Erreakzio-soluzioa 96 putzuko plakan.Hautatu 4 putzu kontrol negatiboa eta kontrol positiboa gehitzeko, eta beste putzuak probatu beharreko laginak gehitzeko.Lagin bakoitzeko 2 hobi anitz daude, 80μL putzu bakoitzeko;
2) Berehala probatu eta irakurri fluoreszentzia-seinalearen balioa RFU0 0min.30 minutuz 37 ℃ iluntasunean jarri ondoren, probatu eta irakurri RFU30 fluoreszentzia seinalearen balioa 30 minutuz berriro.Modu dinamikoa hartzen bada, 0~30min-eko fluoreszentzia-seinale guztiak irakur daitezke.
Proben emaitzen interpretazioa
RFU30≥2×RFU0 bada, probatu beharreko lagina RNasarekin kutsatuta dagoela jotzen da.
Oharra: probatu beharreko lagina oso kutsatuta badago edo substantzia interferentzialak baditu, gerta daiteke RFU0 (probatu beharreko lagina) > RFU0 (kalitate-kontrol positiboa) eta RFU30 (probatu beharreko lagina) < 2 × RFU0 (probatu beharreko lagina). probatu), epai negatibo faltsuetara eramanez.Une honetan, probatu beharreko lagina aurrez diluitu beharko da DNasa eta RNasarik gabeko urarekin, eta ondoren probatu.
Detekzio kuantitatiboa
Probatu beharreko lagina kutsatuta dagoenean eta laginaren RNasaren kontzentrazio-balioa epaitu behar denean, prozedura hauen bidez zehaztu daiteke:
Diluitu RNasa A estandarra (10 mg/mL) Diluzio Buffer Estandar batekin, honela:
Ez. | Prestaketa prozesua | kontzentrazioa |
1 | 2μL RNasa A estandarra +198μL Diluzio Buffer Estandarra | 0. 1mg/mL |
2 | 2μL N. 1 lagina + 198μL Diluzio Buffer Estandarra | 1 × 10-3 mg/ml |
3 | 2μL 2. zenbakia + 198μL Diluzio Buffer Estandarra | 1 × 10-5 mg/mL |
4 | 2μL N. 3 lagina + 198μL Diluzio Buffer Estandarra | 1 × 10-7 mg/mL |
5 | 100μL No.4 lagina+100μL Diluzio Buffer Estandarra | 5×10-8mg/mL |
6 | 100μL No.5 lagina+100μL Diluzio Buffer Estandarra | 2,5×10-8mg/mL |
7 | 100μL N. 6 lagina+100μL Diluzio Buffer Estandarra | 1,25×10-8mg/mL |
8 | 100μL N. 7 lagina+100μL Diluzio Buffer Estandarra | 6,25 × 10-9 mg/mL |
9 | 100μL 8. zenbakia + 100μL Diluzio Buffer Estandarra | 3. 125×10-9mg/mL |
Ondoren, diluitu 6. zenbakia ~ 9. zenbakia DNasa eta RNasarik gabeko urarekin 10 aldiz:
10 | 20μLNo.6 lagin+180μL DNasa&RNasarik gabeko ura | 2,5 × 10-9 mg/mL |
11 | 20μL N. 7 lagina+180μL DNasa&RNasarik gabeko ura | 1,25×10-9 mg/mL |
12 | 20μL 8. zenbakia + 180μL DNasa&RNasarik gabeko ura | 6,25×10- 10 mg/mL |
13 | 20μL 9. zenbakia+180μL DNasa&RNasarik gabeko ura | 3. 13×10- 10 mg/mL |
10. zenbakia ~ 13. zenbakia estandar gisa erabiltzen dira;DNasa & RNasarik gabeko ura 0-kontzentrazioko lagin gisa.
Probatu 0 kontzentrazioko lagina, estandarrak eta kutsatutako lagina elkarrekin detekzio-urratsen arabera, RFU0 eta RFU30 lortzeko.
Kalkulatu ∆RFU = RFU30-RFU0, hartu ∆RFU (0 kontzentrazioa) eta ∆RFU (estandarra) ordenatu gisa eta estandarraren RNasaren kontzentrazioa abzisa gisa (0 kontzentrazioa 0 da), egin egokitzapen lineala eta kalkulatu egokitze ekuazioa y = ax + B, eta r korrelazio-koefizienteak ≥ 0,99 izan behar du.Sartu ∆RFU (lagin kutsatua) ekuazioan y gisa, kalkulatu x, eta biderkatu laginaren aurrediluzio-multiploarekin, kutsatutako laginaren gutxi gorabeherako kontzentrazio-balioa lortzeko.
Oharra: Tresnen seinalearen gorabeherak direla eta, ∆RFU<0 gerta daiteke, momentu honetan, ∆RFU=0 gisa kalkulatzen da.
Detekzio-errendimendua
1. Detektatzeko muga: RNasa A: 0,313 pg/mL, ~ 1,56 × 10-9U/μL
2.Zehaztasuna: lote barruko aldakuntza-koefizientea ≤ 10%, lote arteko aldakuntza-koefizientea ≤ 15
Arreta
1. Lagina gehitzeko eragiketa ahalik eta azkarrena izan behar da.Denbora luzeegiak esperimentuaren zehaztasunari eragingo dio.
2. Entzimak etiketatze-tresna fluoreszente desberdinen parametroak desberdinak dira.Ezarri irabazi egokia lehen probaren aurretik.
3. Erabili aurretik, erreaktibo guztiak astindu beharko dira.Laginak gehitzean, gehitutako laginak entzimaren etiketa-plakaren hondoan gehituko dira putzuaren hormaren goiko aldean gehitzea ekiditeko.Laginak gehitzean, arreta jarri ez zipriztintzen edo ez sortzeko burbuilarik.
4. Kitaren estandarra RNasa A da, eta bere unitate aktiboa entzimaren unitate batek 260 nm-tan 1,0-ko xurgapena handitzea eragiten du legamia RNA 37 °C-tan eta pH 5,0-an hidrolizatzen denean[1].Berrogeita hamar unitate Kunitz unitate baten baliokideak dira gutxi gorabehera[2].
5.RNase exogenoaren kutsadura saihesteko, DNase RNase kanpoan ihinzta daiteke mahai esperimentalaren, eskularruen eta beste gainazalen gainazalean.5 minutu igaro ondoren, garbitu itzazu paperezko eskuoihal garbiekin eta egin ondoren esperimentazio-eragiketak.