Proteinasa K NGS (hautsa)
Katuaren zenbakia: HC4507A
NGS Protease K serina proteasa egonkorra da, entzimaren jarduera handia eta substratuaren espezifikotasun zabala duena.Beraz, askotan proteinak peptido labur bihurtzeko erabiltzen da.NGS Protease K serina proteasa tipikoa da Asp39-Haren69-Ser224Serina proteasetan berezia den hirukote katalitikoa, eta zentro katalitikoa Ca tow inguratuta dago.2+egonkortzeko lotze guneak, entzimaren jarduera handia mantenduz baldintza zabalagoetan.
Zehaztapena
| Itxura | Hauts amorfo zuritik zuria, liofilizatua |
| Jarduera espezifikoa | ≥40U/mg solidoa |
| DNasa | Ez da bat ere detektatu |
| RNasa | Ez da bat ere detektatu |
| Biokarga | ≤50 CFU/g solidoa |
| Azido nukleikoen hondakina | <5pg/mg solidoa |
Propietateak
| Iturria | Tritirachium albuma |
| EC zenbakia | 3.4.21.64(Tritirachium albumeko birkonbinazioa) |
| Pisu molekularra | 29 kDa (SDS-ORRIA) |
| Puntu isoelektrikoa | 7.81 1. irudia |
| pH optimoa | 7,0-12,0 (Guztiek jarduera handia egiten dute) 2. irudia |
| Tenperatura optimoa | 65℃ 3. irudia |
| pH Egonkortasuna | pH 4,5-12,5 (25℃,16h) 4. irudia |
| Egonkortasun termikoa | 50℃-tik behera (pH 8,0, 30min) 5. irudia |
| Biltegiratzeko egonkortasuna | 25 ℃-tan gordeta 12 hilabetez.6. Irudia |
| Aktibatzaileak | SDS, urea |
| Inhibitzaileak | Diisopropil fluorofosfatoa;benzilsulfonil fluoruroa |
Biltegiratzeko baldintzak
Gorde hauts liofilizatua -25 ~ -15 ℃-tan denbora luzez argitik urrun;Disolbatu ondoren, bolumen alikuota egoki batean biltegiratzeko epe laburreko 2-8 ℃ argitik urrun edo epe luzerako biltegiratze-25 ~ -15 ℃ argitik urrun.
Neurriak
Erabili edo pisatzen duzunean babes eskularruak eta betaurrekoak erabili, eta ondo aireztatuta erabili ondoren.Produktu honek larruazaleko erreakzio alergikoak eta begietako narritadura larriak sor ditzake.Arnastuz gero, alergia edo asma sintomak edo disnea sor ditzake.Arnas narritadura eragin dezake.
Unitatearen definizioa
NGS Proteasa K unitate bat kaseina 1 μmol L-tirosinan hidrolizatzeko behar den entzima-kopuru gisa definitzen da determinazio-baldintza estandarretan.
Erreaktiboak prestatzea
| Erreaktiboa | Fabrikatzailea | Katalogoa |
| Kaseina teknikoabehi-esnetik | Sigma Aldrich | C7078 |
| NaOH | Sinopharm KimikaReagent Co., Ltd. | 10019762 |
| NaH2PO4·2H2O | Sinopharm KimikaReagent Co., Ltd. | 20040718 |
| Na2HPO4 | Sinopharm KimikaReagent Co., Ltd. | 20040618 |
| Azido trikloroacetikoa | Sinopharm KimikaReagent Co., Ltd. | 80132618 |
| Sodio azetatoa | Sinopharm KimikaReagent Co., Ltd. | 10018818 |
| Azido azetikoa | Sinopharm KimikaReagent Co., Ltd. | 10000218 |
| HCl | Sinopharm KimikaReagent Co., Ltd. | 10011018 |
| Sodio karbonatoa | Sinopharm KimikaReagent Co., Ltd. | 10019260 |
| Folina-fenola | Sangon Biotech (Shanghai)Co., Ltd. | A500467-0100 |
| L-tirosina | Sigma | 93829 |
I erreaktiboa:
Substratua: % 1 Behi-esnearen disoluzioko kaseina: disolbatu 1 g behi-esnearen kaseina 0,1M sodio fosfato disoluzioko 50 ml-tan, pH 8,0, berotu 65-70 °C-tan 15 minutuz ur-bainuan, irabiatu eta disolbatu, hoztu urarekin, egokituz. sodio hidroxidoa 8,0 pH-ra, eta diluitu 100 ml-ra.
II erreaktiboa:
TCA disoluzioa: 0.1M azido trikloroacetikoa, 0.2M sodio azetatoa eta 0.3M azido azetikoa (pisatu 1.64g azido trikloroacetiko + 1.64g sodio azetato + 1.724ml azido azetikoa segidan, gehitu 50ml ur deionizatuan, eta pH-a 403-ra egokitu. 100 ml).
III erreaktiboa:
0,4 m sodio karbonato disoluzioa (4,24 g sodio karbonato anhidro pisatu eta 100 ml uretan disolbatu)
Erreaktiboa IV:
Folin fenol erreaktiboa: diluitu 5 aldiz ur deionizatuarekin.
V erreaktiboa:
Entzimaren diluitzailea: 0,1 M sodio fosfato disoluzioa, pH 8,0.
Erreaktiboa VI:
L-tirosina soluzio estandarra: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol/ml L-tirosina 0,2M HCl-rekin disolbatuta.
Prozedura
1. Piztu UV-Vis espektrofotometroa eta hautatu neurketa fotometrikoa.
2. Ezarri uhin-luzera 660nm gisa.
3. Piztu ur-bainua, ezarri tenperatura 37 ℃-ra, ziurtatu tenperatura 3-5 minutuz aldatu gabe.
4. Aurrez berotu 0,5 ml-ko substratua 2 ml-ko zentrifuga-hodi batean 37 ℃-ko ur-bainuan 10 minutuz.
5. Erauzi 0,5 ml diluitutako entzima-soluzioa aurrez berotutako zentrifugatzailearen hodira 10 minutuz.Ezarri entzimaren diluitzailea talde huts gisa.
6. Gehitu 1,0 ml TCA erreaktibo erreakzioa amaitu eta berehala.Ondo nahastu eta ur-bainuan inkubatu 30 minutuz.
7. Zentrifugatu erreakzio-disoluzioa.
8. Gehitu osagai hauek zehaztutako ordenan.
| Erreaktiboa | Bolumena |
| Gainekoa | 0,5 ml |
| 0,4M sodio karbonatoa | 2,5 ml |
| Folin fenol erreaktiboa | 0,5 ml |
9. Ondo nahastu 37℃-ko ur-bainuan 30 minutuz inkubatu aurretik.
10. OD660OD gisa zehaztu zen1;kontrol-talde hutsa: entzimaren diluitzailea erabiltzen da entzimaren disoluzioa ordezkatzeko OD zehazteko660OD bezala2, ΔOD=OD1-OD2.
11. L-tirosina kurba estandarra: 0,5 ml-ko kontzentrazio desberdina L-tirosina disoluzioa, 2,5 ml 0,4 M sodio karbonatoa, 0,5 ml Folin fenol erreaktiboa 5 ml zentrifugatzaile-hodian, inkubatu 37 ℃-tan 30 minutuz, OD detektatu.660L-tirosinaren kontzentrazio desberdinetarako, ondoren Y=kX+b kurba estandarra lortu da, non Y L-tirosinaren kontzentrazioa den, X OD den600.
Kalkulua
2: erreakzio-disoluzioaren bolumen osoa (mL)
0,5: entzimaren disoluzioaren bolumena (mL)
0,5: determinazio kromogenikoan erabilitako erreakzio likidoaren bolumena (mL)
10: Erreakzio denbora (min)
Df: Diluzio anitza
C: Entzimaren kontzentrazioa (mg/mL)
Zifrak
1. irudia DNA hondarra
| Lagina | Ave C4 | Azido Nukleikoa Susperraldia (pg/mg) | Berreskuratzea (%) | Nukleikoa guztira Azido ( pg/mg) |
| PRK | 24.66 | 2.23 | %83 | 2.687 |
| PRK+STD2 | 18.723 | 126.728 | — | — |
| STD1 | 12.955 |
— |
— |
— |
| STD2 | 16 | |||
| STD3 | 19.125 | |||
| STD4 | 23.135 | |||
| STD5 | 26.625 | |||
| RNArik gabeko H2O | Zehaztu gabe | — | — | — |
2. irudia pH optimoa
3. irudia Tenperatura optimoa
4. irudia pH-aren egonkortasuna
5. irudia Egonkortasun termikoa
6. Irudia Biltegiratzeko egonkortasuna 25 ℃-tan
