prou
Produktuak
Dnasaren saiakuntzarako kit (fluoreszentzia) HCP0034A Irudi aipagarria
  • Dnasen saiakuntzarako kit (fluoreszentzia) HCP0034A

Dnasen saiakuntzarako kit (fluoreszentzia)


Katuaren zenbakia: HCP0034A

Paketea: 48T/96T

DNasa detektatzeko kit fluoroforoz markatutako DNA zunda batean oinarritzen da.

Produktuaren Deskribapena

Produktuaren datuak

DNasa detektatzeko kit fluoroforoz markatutako DNA zunda batean oinarritzen da.Laginak DNasa jarduerarik ez duenean, zunda egonkorra da eta ez du seinale fluoreszenterik sortzen;laginak DNasaren jarduera daukanean, zunda degradatu egiten da, eta ondorioz, pixkanaka-pixkanaka fluoreszentzia-seinalea hobetzen da;fluoreszentzia-seinalearen hazkunde-tasa positiboki erlazionatuta dago entzimen kopuruarekin eta jarduerarekin.Erabili fluoreszentziazko mikroplaken irakurgailu bat ex/em=485/525nm uhin-luzeran neurtzeko lagina DNasak kutsatuta dagoen zehazteko.


  • Aurrekoa:
  • Hurrengoa:

  • Aplikazio

    Kit hau laginetan DNasa kutsadura detektatzeko erabiltzen da.

     

    Caurkariak

    Izena

    HCP0034A-01

    (192T)

    HCP0034A-02

    (48T)

    10 × erreakzio-disoluzioa

    2,0 ml

    0,5 ml

    DNA zunda

    1 hodi

    1 hodi

    TE buffer

    2,0 ml

    0,5 ml

    DNasa I estandarra (2U/μL)

    20μL

    10μL

    Diluzio Buffer Estandarra

    12 ml

    6 ml

    DNasa&RNasarik gabeko ura

    25 ml

    25 ml

    DNase RNase kanpoan

    50 ml

    50 ml

     

    Biltegiratzea eta egonkortasuna

    1.-25 ~ - 15 ℃-tan garraiatzen da;

    2.Kitaren osagai desberdinak bereizita gordetzen dira tenperaturaren arabera:

    Izena

    tenperatura

    10 × erreakzio-disoluzioa

    -25 ~ -15 ℃

    DNA zunda

    -25 ~ -15 ℃

    TE buffer

    -25 ~ -15 ℃

    DNasa I estandarra (2U/μL)

    -25 ~ -15 ℃

    Diluzio Buffer Estandarra

    -25 ~ -15 ℃

    DNasa&RNasarik gabeko ura

    -25 ~ 30 ℃

    DNase RNase kanpoan

    2 ~ 30 ℃

    1. Gorde ezazu ireki gabeko kita 12 hilabetez.

    2.Gorde kit-a ireki eta gero 6 hilabetez.Gomendatzen da DNA-zunda disoluzioa erabilera bakarreko kantitatearen arabera egitea, argia eta behin eta berriz izoztea eta desizoztea ekiditeko.

     

    Beharrezko ekipoak eta kontsumigarriak

    1.Fluoreszentzia mikroplaken irakurgailua (ex/em=485/525nm uhin-luzera barne)

    2.DNasa eta RNasarik gabeko pipetak eta puntak

    3.DNasa eta RNasarik gabeko EP hodia

    4.DNasa eta RNasarik gabeko 96 putzuko plaka beltza ez gardena

    Erreaktiboak prestatzea

    1.Atera kita eta orekatu giro-tenperaturan (18 ~ 25 ℃), astindu eta nahastu osagaiak, esate baterako, 10 × erreakzio-soluzioa, TE buffer, DNase I estandarra (2U/μL), Diluzio Buffer Estandarra, eta ondoren zentrifugatu berehala.(Zentrifugatu 4000~7000rpm-ra 10 segundoz).

    2.Zentrifugatu DNA-zunda 4000 ~ 7000 rpm-tan 60 segundoz hodiaren hondoan biltzeko, arretaz ireki hodi-tapa eta gehitu 40μL TE tampona DNA-zunda biltegiratzeko soluzio gisa disolbatzeko, DNA-zunda biltegiratzeko soluzio alikuotatuaren arabera. erabilera bakarreko kantitatea eta gorde -25 ~ -15 °C-tan behin eta berriz izoztea eta desizoztea saihesteko.Atera zunda biltegiratzeko soluzioa proba egiten duzun bakoitzean, diluitu 50 aldiz TE bufferarekin (adibidez, gehitu 490 μL TE buffer 12 μL DNA zunda batean) DNA zunda lan egiteko irtenbide gisa.Gorde gainerako DNA zunda funtzionatzen duen soluzioa-25 ~ -15 °C-tan, argia eta behin eta berriz izoztea eta desizoztea saihesteko.

     

    Detektatzeko urratsak

    1.Lehen probaren aurretik irabazi egokia ezartzeko urratsa, sentsibilitatea galtzeko edo seinalearen gainsaturazio arriskua saihesteko.

    1) Tresnen parametroak:

    Plaka astindu 10 ~ 15 s detektatu aurretik;

    Kitzikapen-uhin-luzera λEx=485nm;

    Igorpen-uhin-luzera λEm=525nm;

    Erabili irabazi automatikoaren funtzioa;

    Tenperatura 37 ℃;

    Amaierako modua.

    Ezarri irabazia eskala automatikoan, ahal izanez gero, bestela, hasieran irabazi ertaineko ezarpena erabili.

    Oharra: tresna ezberdinen ezarpen metodoa ez da koherentea, mesedez kontsultatu tresna hornitzaileari xehetasunak lortzeko.

    2) Hautatu 2 putzu 96 putzuko plakan, gehitu 10μL DNA zunda lan-disoluzioa eta 10μL 10×erreakzio-soluzioa putzu bakoitzean;

    3) Gehitu 80μL DNasa eta RNasarik gabeko ur putzu batean, eta gehitu 79μL DNasa eta RNasarik gabeko ur eta 1μL DNasa I estandarra (2U/μL) beste putzuan.

    4) Jarri plaka leku ilun batean 37 °C-tan eta probatu 30 minuturen buruan.

    5) Irabazia autoscalean ezarriz gero, Gain balioa datu-fitxategiko tresna-parametroen barran bistaratuko da, G1 gisa adierazita.

    6) Hasieran irabazi ertaineko ezarpena erabiltzean, kontuan izan behar da: fluoreszentzia handiko balioak tresnaren goiko muga gainditzen badu, irabaziaren balioa behar bezala murriztu behar da;fluoreszentzia-balio altua tresnaren goiko mugatik urrun badago, irabazi-balioa behar bezala handitu beharko litzateke;Azkenik, irabazi-balio egokia lortzen da, G2 bezala adierazita.

     

    2.Ezarri tresnaren parametroak:

    Plaka astindu 10 ~ 15 s detektatu aurretik;

    Kitzikapen-uhin-luzera λEx=485nm;

    Igorpen-uhin-luzera λEm=525nm;

    Ezarri irabaziaren balioa G1 edo G2 got 1 urratsean;

    Tenperatura 37 ℃;

    Mikroplaken irakurgailuak modu zinetikoa onartzen badu, detekzio zinetikoa erabiltzea gomendatzen da, 1 eta 1,5 minutu arteko tartearekin, eta denbora osoa 30 minutukoa da.

     

    3.Laginak prestatzea

    Gomendatutako laginaren bolumena 80μL da.Probatu beharreko lagina 80μL baino txikiagoa bada, diluitu 80μL-ra DNasa eta RNasarik gabeko urarekin.

    Probatu beharreko laginak fluoroforoaren luminiszentzia eragiten duten substantziak dituenean (adibidez, disoluzio ilunak, kontzentrazio handiko substantzia likatsuak edo surfaktanteak), lagina DNasa eta RNasarik gabeko urarekin diluitu behar da, baina kontuan izan diluzio-eragiketak eragina izango duela. sentikortasuna.DNasaren jarduera inhibitzaileak dituen laginarentzat (adibidez, indar ioniko handiko disoluzioak, pH<4 edo pH>9 tamponak, proteina desnaturalizatzaileak, etab.), neurketaren emaitza laginaren disoluzioaren entzimaren jarduera orokorra da, ez. entzimaren jarduera indibiduala.

    Diluitu DNasa I estandarra (2U/μL) Diluzio Buffer Estandar batekin, honela:

    Ez.

    Prestaketa prozesua

    Kontzentrazioa

    1

    2μL DNasa I estandarra + 198μL Diluzio Buffer Estandarra

    2×10-2U/μL

    2

    2μL N. 1 lagina + 198μL Diluzio Buffer Estandarra

    2×10-4U/μL

     Diluitu 2. zenbakia DNasa eta RNasarik gabeko urarekin 10 aldiz:

    3

    20μL 2. zenbakia + 180μL DNasa eta RNasarik gabeko ura

    2×10-5U/μL

    3. zenbakia kontrol positibo gisa erabiltzen da;DNasa eta RNasarik gabeko ura kontrol negatibo gisa erabiltzen da.

    1. Dosifikazioa eta probak

    1) Gehitu 10μL DNA zunda lan-disoluzioa eta 10μL 10×Reaction soluzioa 96 putzuko plakan.Hautatu 4 putzu kontrol negatiboa eta kontrol positiboa gehitzeko, eta beste putzuak probatu beharreko laginak gehitzeko.Lagin bakoitzeko 2 hobi anitz daude, 80μL putzu bakoitzeko;

    2) Berehala probatu eta irakurri fluoreszentzia-seinalearen balioa RFU0 0min.30 minutuz 37 ℃ iluntasunean jarri ondoren, probatu eta irakurri RFU30 fluoreszentzia seinalearen balioa 30 minutuz berriro.Modu dinamikoa hartzen bada, 0~30min-eko fluoreszentzia-seinale guztiak irakur daitezke.

     

    Proben emaitzen interpretazioa

    RFU30≥2×RFU0 bada, probatu beharreko lagina DNasarekin kutsatuta dagoela jotzen da.

    Oharra: probatu beharreko lagina oso kutsatuta badago edo substantzia interferentzialak baditu, gerta daiteke RFU0 (probatu beharreko lagina) > RFU0 (kalitate-kontrol positiboa) eta RFU30 (probatu beharreko lagina) < 2 × RFU0 (probatu beharreko lagina). probatu), epai negatibo faltsuetara eramanez.Une honetan, probatu beharreko lagina aurrez diluitu beharko da DNasa eta RNasarik gabeko urarekin, eta ondoren probatu.

     

    Detekzio kuantitatiboa

    Probatu beharreko lagina kutsatuta dagoenean eta laginaren DNasaren kontzentrazio-balioa epaitu behar denean, prozedura hauen bidez zehaztu daiteke:

    Diluitu DNasa I estandarra (2U/μL) Diluzio Buffer Estandar batekin, honela:

    Ez.

    Prestaketa prozesua

    kontzentrazioa

    1

    2μL DNasa I estandarra +198μL Diluzio Buffer Estandarra

    2×10-2U/μL

    2

    2μL N. 1 lagina +198μL Diluzio Buffer Estandarra

    2×10-4U/μL

    3

    100μL N. 2 lagina+100μL Diluzio Buffer Estandarra

    1×10-4U/μL

    4

    100μL N. 3 lagina+100μL Diluzio Buffer Estandarra

    5×10-5U/μL

    5

    100μL 4. zenbakia+100μL Diluzio Buffer Estandarra

    2,5×10-5U/μL

    6

    100μL No.5 lagina+100μL Diluzio Buffer Estandarra

    1,25×10-5U/μL

    Ondoren, diluitu 3. zenbakia ~ 5. zenbakia DNasa eta RNasarik gabeko urarekin 10 aldiz:

    7

    20μLNo.3 lagin + 180μL DNasa eta RNasarik gabeko ura

    1×10-5U/μL

    8

    20μLNo.4 lagin+180μL DNasa&RNasarik gabeko ura

    5×10-6U/μL

    9

    20μLNo.5 lagin+180μL DNasa&RNasarik gabeko ura

    2,5×10-6U/μL

    10

    20μLNo.6 lagin+180μL DNasa&RNasarik gabeko ura

    1,25×10-6U/μL

    7. zenbakia ~ 10. zenbakia estandar gisa erabiltzen dira;DNasa & RNasarik gabeko ura 0-kontzentrazioko lagin gisa.

    Probatu 0 kontzentrazioko lagina, estandarrak eta kutsatutako lagina elkarrekin detekzio-urratsen arabera RFU0 eta RFU30 lortzeko. Kalkulatu ∆RFU = RFU30-RFU0, hartu ∆RFU (0 kontzentrazioa) eta ∆RFU (estandar) ordenatu eta DNasa I kontzentrazio gisa. estandarraren abzisa gisa (0 kontzentrazioa 0 da), egin egokitzapen lineala eta kalkulatu egokitze-ekuazioa y = ax + B, eta r korrelazio-koefizientea ≥ 0,99 izan behar da.Sartu ∆RFU (lagin kutsatua) ekuazioan y gisa, kalkulatu x, eta biderkatu laginaren aurrediluzio-multiploarekin, kutsatutako laginaren gutxi gorabeherako kontzentrazio-balioa lortzeko.

    Oharra: Tresnen seinalearen gorabeherak direla eta, ∆RFU<0 gerta daiteke, momentu honetan, ∆RFU=0 gisa kalkulatzen da.

     

    Detekzio-errendimendua

    1. Detektatzeko muga: DNasa I: 1,25×10-6U/μL

    2. Zehaztasuna: lote barruko aldakuntza koefizientea ≤ 10%, lote arteko aldakuntza koefizientea ≤ 15%

     

    Arreta

    1. Lagina gehitzeko eragiketa ahalik eta azkarrena izan behar da.Denbora luzeegiak esperimentuaren zehaztasunari eragingo dio.

    2. Entzimak etiketatze-tresna fluoreszente desberdinen parametroak desberdinak dira.Ezarri irabazi egokia lehen probaren aurretik.

    3. Erabili aurretik, erreaktibo guztiak astindu beharko dira.Laginak gehitzean, gehitutako laginak entzimaren etiketa-plakaren hondoan gehituko dira putzuaren hormaren goiko aldean gehitzea ekiditeko.Laginak gehitzean, arreta jarri ez zipriztintzen edo ez sortzeko burbuilarik.

    4. Kitaren estandarra DNasa I da, eta bere unitate aktiboa DNasa I Erreakzio Bufferan 10 minututan pBR322 DNA 1 µg guztiz degradatuko duen entzima-kopuru gisa definitzen da. 1].DNasa I unitate bat 0,3 Kunitz unitatearen baliokidea da[2].

    5. DNase kutsadura exogenoa saihesteko, DNase RNase kanpoan mahai esperimentalaren, eskularruen eta beste gainazalean ihinztatu daiteke.5 minutu igaro ondoren, garbitu itzazu paperezko eskuoihal garbiekin eta egin ondoren esperimentazio-eragiketak.

     

     

    Idatzi zure mezua hemen eta bidali iezaguzu