Proteinasa K mNGS (likidoa)
K proteinasa serina proteasa egonkorra da, substratuaren espezifikotasun handia duena.Jatorrizko egoeran proteina asko degradatzen ditu detergenteen presentzian ere.Kristalen eta egitura molekularren ikerketen frogak adierazten du entzima subtilisinaren familiakoa dela, gune aktiboko hirukote katalitiko batekin (Asp39-Haren69-Ser224).Zatiketa gune nagusiena alfa amino talde blokeatuak dituzten aminoazido alifatiko eta aromatikoen karboxilo taldearen ondoan dagoen lotura peptidikoa da.Bere berezitasun zabalagatik erabili ohi da.K proteinasa hau mNGSrako bereziki diseinatuta dago.Beste K proteinasarekin alderatuta, azido nukleikoen kutsadura are gutxiago dauka errendimendu entzimatiko berarekin, eta horrek hobeto berma dezake mNGS aplikazioa.
Biltegiratzeko baldintzak
2-8 ℃ 2 urtez
Zehaztapena
| Itxura | Likido koloregabetik marroi argira |
| Jarduera | ≥800 U/ml |
| Proteina-kontzentrazioa | ≥20 mg/ml |
| Nickase | Ez da bat ere detektatu |
| DNasa | Ez da bat ere detektatu |
| RNasa | Ez da bat ere detektatu |
Propietateak
| EC zenbakia | 3.4.21.64(Tritirachium albumeko birkonbinazioa) |
| Puntu isoelektrikoa | 7.81 |
| pH optimoa | 7,0- 12,0 1. irudia |
| Tenperatura optimoa | 65 ℃ 2. irudia |
| pH-aren egonkortasuna | pH 4,5- 12,5 (25 ℃, 16 h) 3. irudia |
| Egonkortasun termikoa | 50 ℃-tik behera (pH 8,0, 30 min) 4. irudia |
| Biltegiratzeko egonkortasuna | % 90eko jarduera 12 hilabetez 25 ℃-tan |
| Aktibatzaileak | SDS, urea |
| Inhibitzaileak | Diisopropil fluorofosfatoa;fenilmetilsulfonil fluoruroa |
Aplikazioak
1. Diagnostiko genetikoa egiteko kit
2. RNA eta DNA erauzteko kitak
3. Ehunetatik proteinak ez diren osagaiak erauztea, proteina ezpurutasunak degradatzea, hala nola DNAtxertoak eta heparina prestatzea
4. ADN kromosomaren prestaketa pultsatuko elektroforesiaren bidez
5. Western blot
6. Albumina glikosilatuen erreaktibo entzimatikoak in vitro diagnostikoa
Neurriak
Erabili edo pisatzen duzunean babes eskularruak eta betaurrekoak erabili, eta ondo aireztatuta erabili ondoren.Produktu honek larruazaleko erreakzio alergikoak eta begietako narritadura larriak sor ditzake.Arnastuz gero, alergia edo asma sintomak edo disnea sor ditzake.Arnas narritadura eragin dezake.
Unitatearen definizioa
Unitate bat (U) kaseina hidrolizatzeko 1 μmol ekoizteko behar den entzima-kantitatea bezala definitzen da.tirosina minutuko baldintza hauetan.
Erreaktiboak prestatzea
I erreaktiboa: 1 g esne kaseina 0,1 M sodio fosfato disoluzioko 50 ml-tan disolbatu zen (pH 8,0), 65-70 ℃ uretan inkubatu 15 minutuz, irabiatu eta disolbatu, urez hoztu, sodio hidroxidoarekin 8,0 pH-ra egokitu eta bolumen finkatua. 100ml.
II erreaktiboa: 0.1M azido trikloroacetikoa, 0.2M sodio azetatoa, 0.3M azido azetikoa.
III erreaktiboa: 0,4M Na2CO3irtenbidea.
IV erreaktiboa: forint erreaktiboa ur puruz diluitua 5 aldiz.
V erreaktiboa: entzimaren diluitzailea: 0,1M sodio fosfato disoluzioa (pH 8,0).
VI erreaktiboa: tirosina disoluzioa: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol/ml tirosina 0,2rekin disolbatutaM HCl.
Prozedura
1. 0,5 ml I erreaktiboa aldez aurretik berotzen da 37 ℃-ra, gehitu 0,5 ml entzima-soluzio, ondo nahastu eta inkubatu.37 ℃ 10 minutuz.
2. Gehitu 1 ml erreaktibo II erreakzioa gelditzeko, ondo nahastu eta inkubazioa jarraitu 30min.
3. Zentrifugatu erreakzio-disoluzioa.
4. Hartu 0,5 ml gainditzailea, gehitu 2,5 ml III erreaktiboa, 0,5 ml IV erreaktiboa, ondo nahastu eta inkubatu 37 ℃-tan30 minutuz.
5. OD660OD gisa zehaztu zen1;kontrol talde hutsa: 0,5 ml V erreaktiboa erabiltzen da entzima ordezkatzekoOD zehazteko irtenbidea660OD bezala2, ΔOD=OD1-OD2.
6. L-tirosina kurba estandarra: 0,5 ml-ko kontzentrazio ezberdineko L-tirosina disoluzioa, 2,5 ml III erreaktiboa, 0,5 ml IV erreaktiboa 5 ml zentrifuga-hodi batean, inkubatu 37 ℃-tan 30 minutuz, OD detektatu.660L-tirosinaren kontzentrazio desberdinetarako, ondoren Y=kX+b kurba estandarra lortu da, non Y L-tirosinaren kontzentrazioa den, X OD den600.
Kalkulua
2: erreakzio-disoluzioaren bolumen osoa (mL)
0,5: entzimaren disoluzioaren bolumena (mL)
0,5: determinazio kromogenikoan erabilitako erreakzio likidoaren bolumena (mL)
10: Erreakzio denbora (min)
Df: Diluzio anitza
C: Entzimaren kontzentrazioa (mg/mL)
Erreferentziak
1. Wieger U & Hilz H. FEBS Lett.(1972);23:77.
2. Wieger U & Hilz H. Biochem.Biofisikoa.Erres.Komunik.(1971);44:513.
3. Hilz, H.et al.,Euro.J. Biokimika.(1975);56: 103–108.
4. Sambrook Jet al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. edizioa, Cold Spring HarborLaborategiko prentsa, Cold Spring Harbor (1989).
Zifrak
irudia.1 Optimoa pH
100 mM tampon-disoluzioa: pH 6,0-8,0, Na-fosfatoa;pH8,0-9,0, Tris-HCl;pH 9,0-12,5, Glizina-NaOH. Entzimaren kontzentrazioa: 1 mg/mL
2. irudia Tenperatura optimoa
Erreakzioa 20 mM K-fosfato tamponean pH 8,0.Entzimaren kontzentrazioa: 1 mg/mL
3. irudia pH Egonkortasuna
25 ℃, 16 h-tratamendua 50 mM tampon-disoluzioarekin: pH 4,5- 5,5, azetatoa;pH 6,0-8,0, Na-fosfatoa;pH 8,0-9,0, Tris-HCl.pH 9,0- 12,5, Glizina-NaOH.Entzimaren kontzentrazioa: 1 mg/mL
4. irudia Termikoa egonkortasuna
30 minutuko tratamendua 50 mM Tris-HCl tamponarekin, pH 8,0.Entzimaren kontzentrazioa: 1 mg/mL
5. irudia Biltegiratzea egonkorraty at 25℃
