EndoFree Plasmid Maxi Kit
Kit hau 150 - 300 ml bakterio-disoluziotik ateratzeko egokia da gauean hazten den, bakterioak lisatzeko SDS-alkalino-lisi metodo hobetua erabiliz.Estraktu gordina endotoxinen harrapatzaile berezi batekin konbinatzen da eta zentrifugazio bidez bereizten da endotoxinak kentzeko.Ondoren, silize gelaren mintza disoluzioko DNA plasmidoarekin lotzen da selektiboki gatz handiko eta pH baxuko baldintzetan.Ondoren, garbiketa-buffer bat gehitzen da ezpurutasunak eta beste bakterio-osagai batzuk kentzeko.Azkenik, gatz gutxiko eta pH altuko eluzio-buffer bat erabiltzen da plasmidoaren DNA purua silizio-matrizearen mintzetik.Silice gel-mintzak adsortzio-mintz berezia erabiltzen du, eta zutabearen eta zutabearen arteko adsortzio-kopuruaren aldea oso txikia da eta errepikakortasuna ona da.Fenola, kloroformoa eta beste erreaktibo toxiko batzuk ez dira beharrezkoak, eta ezta etanola hauspetatzeko urratsak ere.Kit hau 0,2 -1,5 mg kopia handiko DNA plasmido hutsa azkar erauzteko erabil daiteke, % 80 -% 90eko erauzketa-tasa batekin.Kitak prozesu-formula berezia erabiltzen du endotoxina kentzen duena, endotoxinaren edukia oso baxua da eta zelulen transfekzio efektua bikaina da.Erauzitako plasmidoa zuzenean erabil liteke entzimaren digestioan, PCRan, in vitro transkripzioan, eraldaketan, sekuentziazioan eta biologia molekularreko beste esperimentu batzuetan.
Biltegiratzeko baldintzak
RNaseA -30 ~ -15 ℃-tan gorde behar da eta ≤0 ℃-tan garraiatu.
Endotoxin Scavenger 2 ~ 8 ℃-tan gorde daiteke hilabetez, -30 ~ -15 ℃-tan gordeta epe luzerako biltegiratzekoeta ≤0℃-tan garraiatzen da.
Beste osagaiak giro-tenperaturan gorde behar dira (15 ~ 25 ℃) eta giro-tenperaturan garraiatu.
Osagaiak
| Osagaiak | 10RXNS |
| RNase A | 750 μL |
| Buffer P1 | 75 ml |
| Buffer P2 | 75 ml |
| Buffer P4 | 75 ml |
| Endotoxinen garbitzailea | 25 ml |
| Buffer PW | 2 × 22 ml |
| Buffer TB | 20 ml |
| FastPure DNA Maxi zutabeak (bakoitza 50 ml-ko bilketa hodi batean) | 10 |
| Endotoxinarik gabeko bilketa-tutua | 2 × 5 |
RNaseA:10 mg/ml, RNA kentzeko erabiltzen da.
Buffer P1:bakterioen esekidura tampona, gehitu RNaseA Buffer P1-ari lehen erabili aurretik.
Buffer P2:bakterioen lisi-buffer (SDS/NaOH duena).
Buffer P4:tampon neutralizatzailea.
Endotoxinen garbitzailea:eraginkortasunez kendu endotoxina plasmido gordinaren erauzketatik.
Buffer PW:garbitu tampona, gehitu ezarritako etanol bolumena lehen erabili aurretik.
Buffer TB:eluzio-buffer.
FastPure DNA Maxi zutabeak:DNA plasmidoaren adsortzio-zutabeak.
Bilketa Hodiak 50 ml:iragazkiak biltzeko hodiak.
Endotoxinarik gabeko bilketa-hodia:DNA plasmidoa biltzeko hodiak.
Prestatutako materialak
Etanol absolutua, isopropanola, 50 ml hondo biribileko zentrifugatzaile-hodiak eta 50 ml endotoxinarik gabekoazentrifuga-hodiak.
Aplikazioak
Produktu hau 150 - 300 ml bakterio-soluzioko plasmidoak eskala handiko erauzketarako egokia da.egun batetik bestera kultua.
Esperimentu Prozesua
1. Hartu 150-200 ml (300 ml baino gehiago) gauean hazitako bakterio-disoluzio eta zentrifugatu.11.000 rpm inguru (12.000 × g) 1 – 2 min.Gaindikoa bota eta bakterioak bildu.
Δ Bakterio-disoluzio 50 ml baino gehiago biltzean, bakterioak bildu daitezke bakterio-soluzioa, zentrifugazioa, gainnadantea baztertuz eta beste urrats batzuk 50 ml-ko hodi berean.
hainbat aldiz.
2. Gehitu 7,5 ml Buffer P1 (mesedez egiaztatu RNaseA Buffer P1-ari gehitu den) zentrifugatzaileanbakterioak dituen hodia eta ondo nahastu zurrunbiloa edo pipetatuz.
Δ Urrats honetan bakterioen birsuepen osoa funtsezkoa da errendimendurako, eta ez luke bakterio-multzorik egon behar berrasekearen ondoren.Ondo nahasten ez diren bakterio-multzorik badaude, lisiari eragingo dio, errendimendu eta garbitasun baxua lortuz.Bakterio-disoluzioaren OD600 0,65 bada, 7,5 ml Buffer P1 erabiltzea gomendatzen da 150 ml bakterio-disoluziotik ateratzean;OD600 0,75 denean, 8 ml Buffer P1 erabili behar dira eta Buffer P2 eta P4 bolumenak horren arabera aldatu behar dira.Bakterio-soluzioaren bolumena 200 ml-ra igotzen bada, gomendatzen daP1, P2 eta P4 Bufferen bolumena proportzionalki handitu da.
3. Gehitu 7,5 ml Buffer P2 2. urratseko bakterioen esekidurari eta astiro-astiro nahastu gora eta behera 6-8.aldiz eta giro-tenperaturan inkubatu 4-5 min.
Δ Alderantzikatu astiro-astiro ondo nahasteko.Zurrunbiloak DNA genomikoaren zatiketa eragingo du, eta ondorioz ateratako plasmidoan DNA genomikoaren zatiak sortuko dira.Une honetan, disoluzioa likatsu eta zeharrargi bihurtzen da, bakterioak guztiz lisatu direla erakutsiz.Iraupena ez da 5 minututik gorakoa izan behar plasmidoen suntsipena ekiditeko.Soluzioa argia ez bada, bakterio gehiegi sor daitezkelisi osatugabea, beraz, bakterio kopurua behar bezala murriztu behar da.
4. Gehitu 7,5 ml Buffer P4 3. urratseko bakterioen esekidurari eta berehala alderantzikatu astiro-astiro 6 – 8 aldiz disoluzioa Buffer P2 guztiz neutraliza dezan.Une honetan, hauspeatu malutsu zuria agertu behar da.Zentrifugatu 11.000 rpm inguru (12.000 × g) baino gehiagotan 10-15 min, gainnadantea arretaz bota 50 ml-ko hondo biribileko zentrifuga-hodi berri batean (norberak prestatutakoa), eta saihestu.hauspeatu zuri mugikorra aspiratu.
Δ Gehitu Buffer P4 eta berehala alderantzikatu ondo nahasteko.Utzi hodia eusten, hauspeakada zuria disoluzio osoan uniformeki banatu arte, neutralizazioan eragina izan dezakeen tokiko prezipitaziorik ez sortzeko.Zentrifugazioaren aurretik malutatsu zuri uniformerik ez badago eta zentrifugazioaren ondoren gainnatzailea garbi ez badago, hodia izan daiteke.beste 5 minutuz zentrifugatu.
5. Gehitu 0. 1 aldiz bolumena (supernatantaren bolumenaren % 10, 2,2 ml inguru) Endotoxin Scavenger-en 4. urratseko gainditzaileari eta alderantzikatu nahasteko.Jarri disoluzioa izotz-bainu batean edo sartu izotz birrinduan (edo hozkailuan izozkailuan) 5 minutuz, disoluzioa uher izatetik argi eta gardenera (edo geldi) aldatu arte.apur bat uhera), eta noizean behin hainbat aldiz nahastu.
Δ Endotoxinen harrapatzailea gainditzaileari gehitu ondoren, gainnatzailea uhartu egingo da, bainagainditzailea argia (edo apur bat uhera) bihurtu behar da izotz-bainuan hoztu ondoren.
6. Gaingaia giro-tenperaturan (> 25 ℃) 10-15 minutuz jarri ondoren, uhartu egingo da.bere tenperatura giro-tenperaturara igotzen da.Ondoren, gainnatzailea alderantzikatu behar da nahasteko.
Δ Giro-tenperatura baxuagoa bada edo erauzketa-denbora murriztu nahi baduzu, gainnadantea 37 ~ 42 ℃ ℃ ur-bainu batean inkubatu daiteke 5-10 minutuz eta hurrengo urratsa gainnadantearen ondoren egin daiteke.uher bihurtzen da.
7. Zentrifugatu gainditzailea 11.000 rpm inguru (12.000 × g) 10 minutuz giro-tenperaturan (tenperatura > 25 ℃ izan behar du) fasea bereizteko.Goiko fase urtsuak DNA dauka eta beheko fase koipetsu urdinak endotoxina eta beste ezpurutasun batzuk ditu.TransferituDNA duen fase urtsua hodi berri batera etageruza koipetsua baztertu.
Δ Zentrifugazioan zehar tenperatura 25 ℃ baino gehiagokoa izan behar da faseen bereizketa eraginkorra ez den bezalatenperatura baxuegia bada gertatzen da.
Δ Faseen bereizketa eraginkorra ez bada, zentrifugazio-tenperatura 30 ℃-ra egokitu daiteke etazentrifugazioaren denbora 15 min arte handitu daiteke.
Δ Ez xurgatu geruza koipetsu urdina endotoxina eta beste ezpurutasun batzuk dituelako.
Mekanismoa
Suspentsio Lisis Neutralizazioa
◇ Gehitu 7,5 ml Buffer P1
◇ Gehitu 7,5 ml Buffer P2
◇ Gehitu 7,5 ml Buffer P4
Endotoxinak kentzea
◇Gehitu 0. 1 aldiz Endotoxin Scavenger-en gainnatzaileen bolumena
Lotura eta Garbiketa
◇ Gehitu isopropanolaren bolumena 0,5 aldiz
◇ Gehitu 10 ml Buffer PW
◇ Gehitu 10 ml Buffer PW
Eluzioa
◇ Gehitu 1 – 2 ml Buffer TB edo endotoxinarik gabeko ddH2O
