mRNA Cap2'-O-Metiltransferasa

mRNA Cap 2´ -O-metiltransferasa vaccinia mRNA Cap 2 ´-O-Methyltransferasearen genea daraman E. coli andui birkonbinatzaile batetik eratorri zen.Entzima honek metil talde bat gehitzen du ARNaren 5' amaieran dagoen kaparen egituraren ondoan dagoen lehen nukleotidoaren 2'-O posizioan. -0) kap- 1 egituraren ondorioz.

Cap1 egiturak itzulpenaren eraginkortasuna areagotu dezake, transfekzio eta mikroinjekzio esperimentuetan mRNAren adierazpena hobetuz.Ezin du pN, ppN, pppN edo GpppN duten RNA erabili 5'-ko muturrean.Kapitulua RNA in vitro transkripzioaren bidez presta daiteke kap analogikoa erabiliz edo Vaccinia Capping Enzyme erabiliz estaldura entzimatikoaren bidez.

Osagaiak

mRNA Cap 2´-O-Metiltransferasa (50U/μL)

10×Capping Erreakzio Buffer

Biltegiratzea

-25 ～- 15 ℃ biltegiratzeko (Saihestu izozte-desizozte ziklo errepikatuak)

Biltegiratze buffer

20 mM Tris-HCl (pH 8,0, 25 ℃), 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0, 1 mM EDTA, % 0, 1 Triton X- 100, % 50 glizerola.

Unitatearen definizioa

Unitate bat 80 nt-ko RNA transkripzioaren 10 pmol metilatzeko behar den entzima-kopuru gisa definitzen da ordubetean 37 °C-tan.

Kalitate-kontroleko entseguak

Exonukleasa: 50U mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferasak 1μg λ-Hind III digestioko DNArekin 37 ℃-tan 16 orduz ez du degradaziorik ematen agarosa gelaren elektroforesiaren arabera.

Endonukleasa: 50 U mRNA Cap 2 ´ -O-Metiltransferasak 1 μg λDNArekin 37 ℃-tan 16 orduz ez du degradaziorik ematen agarosa gelaren elektroforesiaren arabera.

Nickase: 50U mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferasak 1μg pBR322 37 ℃-tan 16 orduz ez du degradaziorik ematen agarosa gelaren elektroforesiaren arabera.

RNasa: 50U mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferasak 1,6μg MS2 RNArekin 4 orduz 37 ℃-tan ez du degradaziorik ematen agarosa gelaren elektroforesiaren arabera.

E. coli DNA: 50U mRNA Cap 2 ´ -O-Metiltransferasaren presentzia aztertzen da.E. coli DNA genomikoa TaqMan qPCR erabiliz, lehengai espezifikoak dituztenekinE. coli 16S rRNA locusa.TheE. coli DNA genomikoaren kutsadura =1 daE. coli genoma.

Bakterioa Endotoxina: LAL-test, Txinako Farmakopea IV 2020 edizioaren arabera, gel-muga probaren metodoa, arau orokorra (1143).Bakterioen endotoxina edukiak = 10 EU/mg izan behar du.

Erreakzio-sistema eta baldintzak

1. Konbinatu Cappped RNA eta RNasarik gabeko H2O kantitate egoki bat 1,5 ml-ko mikrofuge-hodi batean 16,0 μL-ko azken bolumenarekin.

2. Berotu 65 ℃-tan 5 minutuz eta ondoren izotz-bainua 5 minutuz.

3. Gehitu osagai hauek zehaztutako ordenan (Capped RNAren metilaziorako

10 baino gutxiago

*10× Cappping Erreakzio Buffer: 500 mM Tris-HCl (pH 8,0, 25 ℃), 50 mM KCl, 10 mM MgCl2 、 10 mM DTT.

4. Inkubatu 37 ℃-tan ordubetez (200 nt baino gutxiagoko xede-zatirako 2 ordu inkubatzea gomendatzen da).

Aplikazioak

Mikroinjekzio eta transfekzio esperimentuetan mRNAren adierazpena hobetzeko.

Erabilerari buruzko oharrak

1. Erreakzio aurretik, RNA araztu eta nukleasarik gabeko uretan disolbatu behar da, disoluzio guztiek ez dute EDTA eta ioirik eduki behar.

2. Laginaren RNA 65 ℃-tan berotzea gomendatzen da erreakzioa baino 5 minutu lehenago transkripzioaren 5' amaierako bigarren mailako egitura kentzeko.5 ´ -terminal egitura konplexurako 10 minutura luza daiteke.