
Hi-yield T7 in vitro transkripzio erreaktiboa (termoegonkorra)
Hi-yield T7 in vitro transkripzio erreaktiboen kit (termoegonkorra) in vitro transkripzioa egiteko gai da 50 °C-rainoko tenperatura altuagoetan.Kitak errendimendu handiko RNA transkripzioak sintetizatzeko gai da kate bikoitzeko DNA lineala erabiliz T7 sustatzailea txantiloi gisa eta NTPak substratu gisa.Kita egokia da eraldatutako nukleotidoak txertatzeko, biotina markatua, kolorez markatua eta erradiomarkatua lortzeko.Kita kap analogoekin transkripzio bidezko mRNA-en sintesian ere aplika daiteke.Kitak N1-Me-pUTP nukleotido aldatuak ditu alternatiba gisa.
Erreakzio estandar bakoitzak 150-200 μg RNA ematen ditu 1μg DNA txantiloitik.Erreakzio-tamaina eskala daiteke miligramo-mailako RNA eman ahal izateko.
Kittik sintetizatutako RNA aplikazio askotarako egokia da, besteak beste, RNAren egitura eta funtzioen azterketak, erribozimaren biokimika, RNasen babesaren saiakuntzak eta hibridazioan oinarritutako blots, zentzuaren aurkako RNA eta RNAi esperimentua.Kittik sintetizatutako RNA ere egokia da RNA entzimatikoa ekoizteko, vaccinia entzimaren eta 2'-O-metiltransferasaren bidez, eta Poly(A) polimerasarekin bateratuta egotea, in vitro itzulpenerako erabiltzen den RNAren egonkortasuna eta translazio gaitasuna hobetzeko. , transfekzioa eta mikroinjekzioa.
Osagaiak
Osagaia | Kontzentrazioa | Bolumena |
ATP | 100 mM | 100 μL |
CTP | 100 mM | 100 μL |
GTP | 100 mM | 100 μL |
UTP | 100 mM | 100 μL |
N1-Me-pUTP | 100 mM | 100 μL |
10 × Hi-Yield IVT Buffer A | / | 100 μL |
Entzima nahasketa (termoegonkorra) | / | 100 μL |
Biltegiratzeko baldintzak
Garraioa 0°C-tik behera eta biltegiratzea -25~- 15°C-tan.
Protokoloa
•DNA txantiloia prestatzea
ADN plasmido linealizatua, PCR produktuak edo DNA oligonukleotido sintetikoak in vitro transkripziorako txantiloi gisa erabil daitezke kitarekin. DNA txantiloia TE tamponean edo RNasarik gabeko ddH2On disolbatu daiteke.
•Plasmidoa txantiloiak: Plasmido linealizatuak T7 eskualde sustatzaile bat izan behar du DNA txantiloi gisa.Plasmido linealizatuaren kalitateak RNAren errendimenduari eta osotasunari eragiten dio.Garbitasun handieneko plasmido-txantiloi guztiz linealizatua funtsezkoa da kitaren erabilera arrakastatsua izateko, plasmido zirkularra ez baita eraginkortasunez amaitzen.Transkripzio etekin handiena purutasun handieneko txantiloiarekin lortzen da.Luzera zehaztu bateko RNA-transkripzioa sortzeko, DNA plasmidoa guztiz linealizatu behar da mutur latzak edo 5'-gainak sortzen dituen murrizketa-entzima batekin.Laborategiko metodoen bidez araztutako plasmido linealizatua RNasa, proteina, RNA eta gatz kutsatzailerik gabe egon daiteke.
• PCR txantiloiak: T7 RNA polimerasa sustatzailea orientazio egokian duten PCR produktuak transkriba daitezke.PCR araztutako produktuekin etekin hobeak lortuko dira, nahiz eta PCR nahasketak zuzenean erabil daitezkeen.
•Sintetikoa DNA oligonukleotidoak:ADN oligonukleotido sintetikoak, guztiz kate bikoitzak edo gehienbat kate bakarrekoak diren T7 sustatzaile-sekuentzia batekin transkriba daitezke.
RNA Sintesia Protokoloak
Eskularruak janztea eta nukleasarik gabeko hodiak eta erreaktiboak erabiltzea gomendagarria da RNasa kutsatzea saihesteko.Bolumen txikiko erreakzioak nukleasarik gabeko mikrofuge-hodietan edo PCR tira-hodietan muntatu behar dira.
RNA konbentzionala sintesia
1. Desizoztu beharrezko kitaren osagaiak, nahastu eta pultsatu bira mikrofogan hodien hondoan soluzioak biltzeko.Segi izotzean.
2.Erreakzio asko egiteko asmoa baduzu, komenigarria da nahasketa nagusi bat prestatzea 10× Hi-Yield IVT Buffer eta lau erribonukleotido (NTP) soluzioen bolumen berdinak konbinatuz.Erabili 10 µl nahasketa nagusia erreakzio bakoitzeko.
3. Muntatu erreakzioa giro-tenperaturan hurrenkera honetan:
Erreaktiboa | Zenbatekoa |
Nukleasarik gabeko ura | X μL |
10 × Hi-Yield IVT Buffer A | 2 μL |
ATP/CTP/GTP/UTP *(100 mM bakoitza) | 2 μL bakoitza (10 mM bakoitza finala) |
DNA txantiloia | Y μL (1 μg) |
Entzima nahasketa (termoegonkorra) | 2 μL |
Erreakzio Bolumena Guztira | 20 μL |
* Produktuaren immunogenizitatea murrizteko, UTP N1-Me-pUTPrekin ordezkatu daiteke azken kontzentrazio berean.
4. Ondo nahastu, pultsu-biratu mikrofugean.Inkubatu 37 °C-tan 2 orduz, edo 50 °C-tan ordubetez, tenperatura altuko erreakzioa behar bada.
5. DNA digestioa: DNA txantiloia kentzeko, gehitu 10U DNasa I 20 μL erreakzio bakoitzean, ondo nahastu eta 37 ℃-tan inkubatu 30 minutuz.
RNA kapatuaren sintesia
Ohiko RNA sintesiaren antzeko protokoloa, erreakzioa muntatzeko urratsa izan ezik.Muntatu RNA kamutsaren sintesiaren erreakzioa giro-tenperaturan, hurrenkera honetan:
Erreaktiboa | Zenbatekoa |
Nukleasarik gabeko ura | X μL |
10 × Hi-Yield IVT Buffer A | 2 μL |
ATP/CTP/GTP/UTP *(100 mM bakoitza) | 2 μL bakoitza (10 mM bakoitza finala) |
Txano analogikoa (100 mM) | 1,6 μL |
DNA txantiloia | Y μL (1 μg) |
Entzima nahasketa (termoegonkorra) | 2 μL |
Erreakzio Bolumena Guztira | 20 μL |
*** Beharrezkoa bada, Cap1 (3'OH AG) eta cap1 (3'OMe AG) analogo gisa erabil daitezke.Gomendatu dugu gure transkripzio-erreaktiboa Co-capping T7 invitro transkripzio erreaktiboa (pUTP, CAP GAG (3'OMe), pUTP, CAP GAG, N1-Me- pUTP, CAP GAG (3'OMe) eta N1-Me-pUTP, CAP GAG.
mRNA arazketa
• Fenola: Kloroformo gehigarriazioa eta etanola Prezipitazioa
Proteinak eta nukleotido aske gehienak kentzeko, fenola: kloroformoaren erauzketa eta RNA transkripzioen etanola hauspeatzea da hobetsitako metodoa.
1.Egokitu erreakzio bolumena 180 μL-ra, nukleasarik gabeko 160 μL ur gehituz.Gehitu 20 μL sodio azetato 3M, pH 5,2, ondo nahastu.
2. Erauzi 1:1 fenol/kloroformo nahasketa bolumen berdinarekin, zentrifugatu 10000 rpm-an 5 minutuz.Bildu ur-fasea eta transferitu hodi berri batera.
3. Ondoren, kloroformo bolumen berdineko bi erauzketa egiten dira.Bildu ur-fasea eta transferitu hodi berri batera.
4. ARNa 2 etanol bolumenekin hauspeatu zen.Inkubatu -20 ℃-tan gutxienez 30 minutuz eta bildu paleta zentrifugatuz 15 minutuz.Kontu handiz kendu gainnatzailea.
5. Garbitu paleta 150 μL~200 μL hotz %70eko etanolarekin.
6. Airearekin lehortu paleta 2 minutuz eta suspentsatu berriro 100 μL ~ 200 μL RNasik gabeko uretan edo beste buffer batzuetan.
• LiCl prezipitazioa
RNAren LiCl hauspeaketa eraginkorra da barneratu gabeko NTP eta entzima gehienak kentzeko.
1. Gehitu LiCl disoluzio bolumen berdina (5M), ondo nahastu.
2. Inkubatu -20 ℃-tan gutxienez 30 minutuz.Zentrifugatu 4 ℃-tan 12000 rpm-tan 15 minutuz RNA paletarazteko.Kontu handiz kendu gainditzailea.
3. Erretxinatu paleta 200 μL aurrehozketaren %70eko etanol gehituz.Kontuz kendu etanola.Errepikatu urratsak 2 ~ 3 aldiz.
4. Airean lehortu paleta 5 ~ 10 minutuz eta suspentsatu berriro 100 μL ~ 200 μL RNasarik gabeko uretan edo beste buffer batzuetan.
• Bira zutabeen arazketa
Spin zutabeek barneratu gabeko NTPak, proteinak eta gatzak kenduko dituzte.
• Ale magnetikoak purifikzioa
Ale magnetikoen arazketa inkorporatu gabeko nukleotidoak, proteinak eta gatzak ken ditzake.
Erreakzio-produktuen kuantifikazioa
• U-ren kuantifikazioaV argiaren xurgapena: Erreakzio-produktuek arazketa behar dute, erreakzio-nahasteetan barneratu gabeko nukleotidoek eta DNA txantiloiek irakurketari eragingo diotelako.UV espektrofotometria 260 nm-an neurtzeak erraz lor dezake RNA kontzentrazioa.Kate bakarreko RNArako, 1 A260 40 μg/mL-ko RNA kontzentrazioari dagokio.
• Kuantifikazioa by tindagai: Erreakzio-produktuen kuantifikazioa Ribogreen koloratzailearekin erabil daiteke arazterik gabe, barneratu gabeko nukleotidoek ez baitute RNA produktuen ebaluazioan eragingo.
Oharrak
• Transkripzio-erreakzioa RNasarik gabeko ingurunean egin behar da.Eskularruak erabiltzea komeni da.Puntak, hodiak eta urak nukleasarik gabekoak izan behar dute.
• NTPen azken kontzentrazio optimo guztiak 10 mM-koak dira, eta NTPen azken kontzentrazioa alda dezakezu benetako egoeraren arabera.
• ARNaren sintesi-erreakzio-nahasketa giro-tenperaturan prestatu behar da, izan ere, espermidinaren aurrean DNA hauspea daiteke 4°C-tan.
• Luzera egokiko transkripzioen etekina gutxitzen da txantiloiaren DNA guztiz linealizatuta badago.
• Erreakzio-nahasketa gora edo behera egin daiteke.
• Buffera nahastu erabili aurretik substantzia disolbaezinak guztiz disolbatu arte, berriro urtu ondoren tamponak substantzia disolbaezinak dituela ikusten bada.
• 300 bp baino laburragoak diren transkripzioak dituzten erreakzioetarako, 4-8 orduko inkubazioak 37 ℃-tan etekin handiagoa eman beharko luke.
• RNA sintesiaren transkripzio estandarrak egiteko erabiltzen den DNA txantiloiak T7 sustatzaile-sekuentzia bat izan behar du eta ondoren GGG hasierako sekuentziaz, T7 RNA polimerasak GTPren afinitate handiagoa duelako.
• Ko-transkripzio sistemarekin mRNA sintesirako erabiltzen den DNA txantiloiak T7 sustatzaile-sekuentzia izan behar du eta ondoren AGG hasierako sekuentzia.
Arazoak konpontzea
a) Full-len etekin baxuagth RNA:
Transkripzio-erreakzioak luzera osoko RNA sortzen badu, baina etekina espero baino nabarmen txikiagoa bada, baliteke DNA txantiloian dauden kutsatzaileak RNA polimerasa inhibitzea, edo DNAren kontzentrazioa baxuegia edo okerra izatea.
Iradokizuna: DNA txantiloiaren arazketa gehigarria gomendatzen da.
b) RNA transkripzioa zikintzen denaturing Gela:
RNA agarosa edo poliakrilamida gel desnaturalizatzailean degradatuta agertzen bada, DNA txantiloia edo esperimentu prozesua RNasarekin kutsatuta dago.
Iradokizuna: Plasmidoaren DNA txantiloia RNasarekin kutsatuta badago, egin fenol/kloroformo erauzketa eta etanol hauspeatu.Ziurtatu esperimentuan erabilitako aholkuak eta hodiak RNasik gabekoak direla.Mesedez, erabili laborategiko bata, maskara eta botatzeko eskularruak.
c) RNA transkripzioa espero baino tamaina handiagoa:
Gel desnaturalizatzaile batean RNA transkripzioa espero baino handiagoa bada, plasmidoaren DNA txantiloia guztiz digeritua izan daiteke.Egitura sekundario sendoak egoteak RNA transkripzioa guztiz desnaturalizatzea eragin dezake.
Iradokizuna: egiaztatu txantiloia digestio osoa dagoela, digeritu gabeko plasmidoa baieztatzen bada, errepikatu murrizketa entzimaren digestioa.ADN txantiloiaren bigarren mailako egiturak murriztea sekuentziaren diseinuaren fasean.
d) RNA transkripzioa de txikiagoak tamaina baino espero:
Gel desnaturalizatzaileen analisiak espero den tamaina baino banda txikiagoen presentzia erakusten badu, ziurrenik polimerasaren amaiera goiztiarra izateagatik izango da.T7 RNA polimerasaren amaiera-seinaleen antza duten sekuentzia batzuek amaiera goiztiarra eragingo dute.
Iradokizuna: transkripzio-erreakzioa tenperatura baxuagoetan inkubatzeak, adibidez 30 °C-tan, luzera osoko transkripzioaren proportzioa handitu dezake, baina etekina murriztuko da.GC txantiloi aberatsetarako edo egitura sekundariodun txantiloietarako, 42 °C-tan inkubatzeak luzera osoko transkripzioaren etekina hobe dezake.