Kate bikoitzeko RNA (dsRNA) ELISA KIT

Kit hau Entzimekin Lotutako Immunosorbent Assay (ELISA) akoplamendua da biotina-estreptabidina sistemarekin, 60 base-pare (bp) baino gehiagoko luzera duen dsRNAren neurketa kuantitatiboa egiteko, sekuentzia edozein dela ere.Plaka aurretiaz estali da dsRNAren aurkako antigorputzarekin.Laginean dagoen dsRNA gehitzen da eta putzuetan estalitako antigorputzekin lotzen da.Eta, ondoren, anti-dsRNA antigorputz biotinilatua gehitzen da eta laginaren dsRNArekin lotzen da.Garbitu ondoren, HRP-Streptavidin gehitzen da eta Biotinylated anti-dsRNA antigorputzarekin lotzen da.Inkubazioaren ondoren, lotu gabeko HRP-Streptavidin garbitu egiten da.Ondoren, TMB substratu-soluzioa gehitzen da eta HRP-k katalizatzen du kolore urdineko produktu bat ekoizteko, horia bihurtzen den geldialdi azidoa gehitu ondoren.Horiaren dentsitatea plakan atzemandako dsRNA-ko kantitatearen helburuko proportzionala da.Absorbantzia 450 nm-tan neurtzen da.

Aplikazio

Kit hau hondar dsRNA neurtzeko da.

Kitaren osagaiak

Biltegiratzea eta Egonkortasuna

1. Erabiltzen ez den kitetarako: kit osoa 2 ~ 8 ℃-tan gorde daiteke balio-bizitzan.Biltegiratzeko egonkortasunerako argi indartsua saihestu behar da.

2. Erabilitako kitrako: mikroplaka ireki ondoren, estali erabili gabeko putzuak plaka zigilatzailearekin eta itzuli lehorgailua duen paper-poltsara, zigilatu paper-poltsa eta itzuli 2 ~ 8 ℃-ra ahalik eta azkarren erabili ondoren.Beste erreaktiboak 2 ~ 8 ℃-ra itzuli behar dira ahalik eta azkarren erabili ondoren.

Beharrezko materiala, baina hornitu gabe

1. Mikroplaken irakurgailua 450±10nm-ko iragazkia duena (hobe 450 eta 650 nm-ko uhin-luzeran detektatzeko gai bada).

2. Mikroplaken astingailua.

3. RNasarik gabeko puntak eta zentrifuga-hodiak.

Eragiketa Fluxu-diagrama

Hasi aurretik

1. Ekarri kitaren osagai eta lagin guztiak giro-tenperaturara (18-25 ℃) erabili aurretik.Kit-a aldi batean erabiliko ez bada, mesedez, atera zerrendak eta erreaktiboak oraingo esperimenturako, eta utzi gainerako zerrendak eta erreaktiboak beharrezko egoeran.

2. Garbiketa-buffer: diluitu 20× garbiketa-buffer kontzentratuaren 40 ml ur deionizatu edo destilatuarekin 760 ml-rekin, 1× garbiketa-bufferren 800 ml prestatzeko.

3. Estandarra: laburki bira edo zentrifugatu stock-soluzioa erabili aurretik.Emandako lau estandarren kontzentrazioa 5ng/μL da.UTP eta pUTP dsRNA estandarrentzat, mesedez diluitu stock-soluzioa 1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312,0.0156,0pg/μL-ra STE bufferarekin kurba estandarra marrazteko.N1-Me-pUTP dsRNA estandarrentzat, mesedez diluitu stock-soluzioa 2,1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312, 0pg/μL STE bufferarekin kurba estandarra marrazteko.5-OMe-UTP dsRNA estandarrentzat, diluitu soluzioa 4,2,1,0.5, 0.25,0.125,0.0625, 0pg/μL STE bufferarekin kurba estandarra marrazteko.Estandarrak hurrengo grafiko gisa diluitzea gomendatzen dugu:

4. Biotinilatutako detekzio-antigorputza eta HRP-estreptavidinaren lan-soluzioa: bira eman edo zentrifugatu stock-soluzioa erabili aurretik.Diluitu itzazu lan-kontzentraziora diluzio tamponarekin.

5. TMB azpiegoera: aspiratu disoluzioaren behar den dosia punta esterilizatuekin eta ez bota hondar-disoluzioa berriro ontzira.TMB azpiegoera argiarekiko sentikorra da, ez jarri TMB substratua argira denbora luzez.

Protokoloa erabiltzea

1. Saiakuntzarako behar diren tira kopurua zehaztu.Sartu zerrendak markoetan erabiltzeko.Entsegu honetan erabiltzen ez diren gainerako plaka-zerrendak poltsan lehorgailuarekin sartu behar dira.Itxi poltsa ondo hozkailuan gordetzeko.

2. Gehitu 100μL estandarraren, zuriaren eta laginen diluzio bakoitza dagokien putzuetan.Estali plaka zigilatzailearekin.Inkubatu ordubete giro-tenperaturan 500 rpm-ko astinduz.Laginak STE bufferarekin diluitu behar dira kontzentrazio egokira azterketa zehatza izateko.

3. Garbiketa urratsa: Aspiratu disoluzioa eta garbitu 250μL garbiketa-buffer batekin putzu bakoitzean eta utzi 30 segundoz.Utzi garbiketa-bufferra guztiz, plaka paper xurgatzaile batean sartuz.Guztiz garbitu 4 aldiz.

4. Gehitu 100μL biotinilatutako detekzio-antigorputz lan-disoluzio putzu bakoitzean.Estali plaka zigilatzailearekin.Inkubatu ordubete giro-tenperaturan 500 rpm-ko astinduz.

5. Errepikatu garbiketa urratsa.

6. Gehitu 100μL HRP-streptavidin lan-disoluzio putzu bakoitzean.Estali plaka zigilatzailearekin.Inkubatu 30 minutuz giro-tenperaturan 500 rpm-ko astinduz.

7. Errepikatu garbiketa urratsa berriro.

8. Gehitu 100μL TMB substratu-soluzio putzu bakoitzean.Estali plaka zigilatzailearekin.Inkubatu 30 min RT-n Argitik babestu.Likidoa urdin bihurtuko da substratu-soluzioa gehituta.

9. Gehitu 50μL stop-disoluzio putzu bakoitzean.Likidoa horia bihurtuko da stop-soluzioa gehituta.Ondoren, exekutatu mikroplaken irakurgailua eta egin neurketa 450 nm-an berehala.

Emaitzen kalkulua

1. Batez bestekoa estandar, kontrol eta lagin bakoitzaren irakurketa bikoiztuak eta kendu batez besteko zero dentsitate optiko estandarra.Eraiki kurba estandar bat xurgantzia (Y) ardatz bertikalean eta dsRNAren kontzentrazioa (X) ardatz horizontalean.

2. Gomendatzen da kalkulua ordenagailu bidezko kurbak egokitzeko softwarearekin egitea, hala nola, kurba aditua 1.3 edo ELISA Calc bezalako 5 edo 4 parametroko doikuntza ez-linealaren ereduan.

Errendimendua

1. Sentikortasuna:

detekzio-muga behekoa: ≤ 0,001pg/μL (UTP-, pUTP-, N1-Me-pUTP-dsRNA-rako), ≤ 0,01pg/μL (5-OMe-UTP-dsRNA-rako).

kuantifikazioaren beheko muga: 0,0156 pg/μL (UTP-, pUTP-dsRNArako), 0,0312 pg/μL (N1-Me-pUTP-dsRNArako), 0,0625 pg/μL (5-OMe-UTP-dsRNArako).

2. Zehaztasuna: Entsegu barneko CV ≤% 10, Inter-Saien CV ≤% 10

3. Berreskuratzea:% 80 ~% 120

4.Linealtasuna:0,0156-0,5pg/μL (forUTP-,pUTP-dsRNA) 0,0312-1pg/μL (forN1-Me-pUTP dsRNA), 0,0625-1pg/μL (5-OMe-UTP-dsRNArako).

Gogoetak

1. TMB erreakzio tenperatura eta denbora kritikoa da, mesedez kontrolatu argibideen arabera zorrozki.

2. Saiaketaren erreproduzigarritasun eta sentikortasun ona lortzeko, ezinbestekoa da plakak behar bezala garbitzea erreakzionatu gabeko erreaktiboen gehiegizkoak kentzeko.

3. Erreaktibo guztiak ondo nahastu behar dira erabili aurretik eta saihestu laginak edo erreaktiboak gehitzean bumbleak.

4. Garbiketa-buffer kontzentratuan kristalak sortu badira (20x), berotu 37 ℃-ra eta nahastu astiro-astiro kristalak guztiz disolbatu arte.

5. Saihestu sodio azida (NaN3) duten laginak aztertzea, HRP jarduera suntsitu baitezake dsRNA kopurua gutxiesteko.

6. Saihestu RNasen kutsadura saiakuntzan zehar.

7. Estandarra/lagina, detekzio-antigorputza eta SA-HRP ere egin daitezke RT-n astindu gabe, baina horrek detekzio-sentsibilitatea bider batean murriztea eragin dezake.Kasu honetarako, UTP eta pUTP dsRNA estandarrak 2pg/μL-tik diluitzea gomendatzen dugu, N1-Me-pUTP dsRNA estandarrak 4pg/μL-tik diluitzea eta 5-OMe-UTP dsRNA estandarra 8pg/μL-tik diluitzea.Horrez gain, inkubatu HRP-streptavidin disoluzioa 60 minutuz giro-tenperaturan.Ez erabili matrazearen astingailuak, matrazearen astingailuak emaitza okerra ekar dezakeelako.

Emaitza tipikoa

1. Kurba estandarraren datuak

2. Kurba estandarraren kalkulua

3. Liner detektatzeko tartea: 0,0312- 1pg/μL