2×Sensi Direct Premix-UNG (Probe qPCR)
Katuaren zenbakia: HCB5151A
SensiDirect Premix-UNG (Probe qPCR) laginetatik zuzenean PCR egiteko diseinatuta dago, DNA erauzketarik edo laginak prestatu gabe.Erreaktibo hau abiarazte beroko DNA polimerasa, urazil DNA glikosilasa (UNG), RNasa inhibitzailea, MgCl osatzen dute.2, dNTPak (dUTP-arekin ordez dTTParekin), eta egonkortzaileak, PCR kuantitatiborako (qPCR).Erreaktibo honek inhibitzaile-tolerantzia handia du, eta, beraz, zuzenean aplika daiteke eztarriko laginak, listua, odol osoa koagulatuaren aurkakoa, plasma eta seruma DNA atera gabe bezalako laginak detektatzeko.Erreaktiboak qPCRrako buffer propioa erabiltzen du DNA polimerasa antiinhibitzailearen eta UNG entzimaren entzima mistoekin.Hori dela eta, inhibitzaileak dituzten laginetan xede-geneen anplifikazio ona lor dezake eta PCR hondar eta aerosolen kutsadurak eragindako anplifikazio positibo faltsuak galarazi.Erreaktibo hau PCR kuantitatibo fluoreszente gehienekin bateragarria da, hala nola Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad, Roche eta abarrekin.
Osagaiak
1. 50×SensiDirect Enzyme/UNG Mix
2. 2×SensiDirect Premix Buffer (dUTP)
Biltegiratzeko baldintzak
Osagai guztiak -20 ℃-tan mantendu behar dira epe luzerako biltegiratzeko eta 4 ℃ 3 hilabetez.Mesedez, ondo nahastu desizoztu ondoren eta zentrifugatu erabili aurretik.Saihestu maiz izozte-desizoztea.
Bizikleta Protokoloa
| Urratsa | Tenperatura | Denbora | Zikloa |
| Digestioa | 50℃ | 2min | 1 |
| Polimerasaren aktibazioa | 95℃ | 1-5min | 1 |
| Desnaturalizatzea | 95℃ | 10-20 hamarkada | 40-50 |
| Errekostea/Luzapena | 56-64 ℃ | 20-60 hamarkada |
Pipeteatzeko jarraibideak
| Erreaktiboa | Bolumena bakoitzeko erreakzioa | Erreakzio bakoitzeko bolumena | Azken Kontzentrazioa |
| 2×SensiDirect Premix Buffer (dUTP) | 12,5 µL | 25µl | 1× |
| 50×SensiDirect Enzyme/UNG Mix | 0,5 µL | 1µL | 1× |
| 25×Primer-Probe Mix1, 2 | 1µL | 2µl | 1× |
| Lagina3, 4 | - | - | - |
| ddH2O | - | - | - |
| Bolumen osoa | 25 μL | 50 μL | - |
1. Primeraren azken kontzentrazioa 0,2μM-koa izan ohi da.Emaitza hobeak lortzeko, lehen kontzentrazioa optimizatu daiteke 0,2-1μM tartean.
2. Orokorrean, zundaren kontzentrazioa 0,1-0,3μM bitartekoa optimizatu daiteke.Zundaren kontzentrazio optimoa denbora errealeko PCR anplifikazio-tresnarekin, zunda motarekin eta etiketatze fluoreszente-substantzia motarekin erlazionatuta dago.Mesedez, ikusi tresnaren eskuliburua edo zunda fluoreszente bakoitzaren eskakizun espezifikoak.
3. Lagin mota ezberdinek inhibitzaile mota eta eduki desberdinak dituzte eta xede genearen kopia-kopurua.Laginaren bolumena benetako egoeraren arabera kontuan hartu behar da.Egin laginaren diluzio bat nukleasarik gabeko ura edo TE Buffer gehituz, beharrezkoa bada.
4. Lagin ezberdinen gomendatutako bolumena:
| Lagina | Bolumena 50 batentzat μL erreakzioa | Gehienez ratioa |
| Odol osoa antikoagulatua | 2,5 μL | 5% |
| Plasma | 15 μL | %30 |
| Seruma | 10 μL | %20 |
| Eztarriko zurtoina | 10 μL | %20 |
| Listua | 10 μL | %20 |
Kalitate kontrola
1. Funtzioaren detekzioa: qPCRren sentsibilitatea, espezifikotasuna eta errepikakortasuna.
2. Nukleasa-jarduera exogenorik ez: endonukleasa exogenorik eta exonukleasa-kutsadurarik ez.
Produktuaren oharrak
1. Produktu honek abiarazte beroko DNA polimerasa mota berri bat erabiltzen du, 1-5 minututan aktibatu daitekeena. Bere erreakzio buffer optimizatu denez, egokiago da fluoreszentzia bikoitzeko edo anitzeko PCR kuantitatiborako zunda metodoa erabiliz.
2. PCR anplifikazioaren Rn balioa baxuegia bada edo anplifikazioa, jakina, inhibituta badago, laginaren kantitatea gutxituz gero, erreakzio-bolumena handitzeak edo laginaren aurreko diluitzeak emaitzak hobetu ditzake.
3. Odola, listua, gernua, eztarriko zurtoina eta abar biltzeak irizpide klinikoen eskakizunei jarraitu behar die, eta lagin freskoa erabil daiteke azido nukleikoen degradazioa saihesteko.
4. Anplikoi ezberdinek dUTP-ren erabilera-eraginkortasuna eta UNGarekiko sentsibilitatea desberdinak dituztenez, erreaktiboak optimizatu behar dira UNG sistema erabiltzean detekzio-sentsibilitatea gutxitzen bada.Mesedez, jar zaitez gurekin harremanetan laguntza teknikorako behar izanez gero.
5. Urrats bakarreko erreakzioen artean eramandako PCR produktuen anplifikazioa saihesteko, anplifikaziorako eremu esperimental eta pipeta dedikatu behar dira.Eskularruekin funtzionatu eta aldatu maiz eta ez ireki erreakzio-hodia PCR anplifikazioaren ondoren.
