Vaccinia birusa estaltzeko entzima

Vaccinia birusaren estaldura entzima E. coli birkonbinatzaile batetik eratorria da Vaccinia entzimaren estalduraren geneak daramatza.Entzima bakar hau bi azpiunitatez (D1 eta D12) osatuta dago eta hiru jarduera entzimatiko ditu (RNA trifosfatasa eta guanililtransferasa D1 azpiunitatearen bidez eta guanina metiltransferasa D12 azpiunitatearen bidez).Vaccinia birusaren estaldura entzima eraginkorra da txapelaren egituraren eraketa katalizatzeko, zeinak 7-metilguanilatoaren txapelaren egitura (m7Gppp, Cap 0) RNAren 5′ amaieran bereziki lotu dezakeena.Kaparen egiturak (Cap 0) paper garrantzitsua betetzen du eukariotoetan mRNA egonkortzean, garraiatzen eta itzultzean.RNA erreakzio entzimatikoen bidez estaltzea metodo eraginkor eta sinplea da, eta horrek RNAren egonkortasuna eta itzulpena nabarmen hobetu ditzake in vitro transkripzioa, transfekzioa eta mikroinjekziorako.

Osagaiak

Vaccinia birusa estaltzeko entzima (10 U/μL)

10×Capping Buffer

Biltegiratzeko baldintzak

-25～- 15℃ biltegiratzeko (Saihestu izozte-desizozte ziklo errepikatuak)

Biltegiratze buffer

20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 100 mM NaCl,

1mM DTT, 0. 1mM EDTA, % 0. 1 Triton X- 100, % 50 glizerola.

Unitatearen definizioa

Vaccinia birusaren Capping Enzyme unitate bat 10 pmol GTP 80nt transkripzio batean 37 °C-tan ordubetean sartzeko behar den entzima gisa definitzen da.

Kalitate kontrola

Exonukleasa:Vaccinia birusaren 10U-k 1 μg λ-Hind III DNA digeritzen duen 10U-k 16 orduz 37 ℃-tan ez du degradaziorik ematen agarosa gelaren elektroforesiaren arabera.

Endonukleasa:Vaccinia birusaren 10U-k 1 μg λDNArekin 37 ℃-tan 16 orduz ez du degradaziorik ematen agarosa gelaren elektroforesiaren arabera.

Nickase:Vaccinia birusaren 10U-k 1 μg pBR322 37 ℃-tan 16 orduz estaltzeko entzimak ez du degradaziorik ematen agarosa gelaren elektroforesiaren arabera.

RNasa:Vaccinia birusaren 10U-k 1,6 μg MS2 RNArekin 37 ℃-tan 4 orduz estaldura entzimak ez du degradaziorik ematen agarosa gelaren elektroforesiaren arabera.

1.coli DNA:Vaccinia birusaren 10U Capping Enzyme E. coli DNA genomikoaren presentzia aztertzen da TaqMan qPCR erabiliz, E. coli 16S rRNA locuserako abiarazle espezifikoak dituztenekin.E. coli DNA genomikoaren kutsadura ≤1 E. coli genoma da.

2.Bakterioa Endotoxina: LAL-proba, Txinako Farmakopea IV 2020 edizioaren arabera, gel-muga probaren metodoa, arau orokorra (1143).Bakterioen endotoxina edukiak ≤10 EU/mg izan behar du.

Erreakzio-sistema eta baldintzak

1. Kapatze-protokoloa (erreakzio bolumena: 20 μL)

Prozedura hau 10μg RNAren (≥100 nt) kapping erreakziorako aplikagarria da eta eskakizun esperimentalen arabera eskala daiteke.

I) Konbinatu 10μg RNA eta Nukleasarik gabeko H2O 1,5 ml-ko mikrofuge-hodi batean 15,0 μL-ko azken bolumenarekin.*10 × Tapoi Buffer: 0,5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25 ℃, pH 8,0)

2) Berotu 65 ℃-tan 5 minutuz eta ondoren izotz-bainua 5 minutuz.

3) Gehitu osagai hauek zehaztutako ordenan

* 10 × Tapoi Buffer: 0,5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25 ℃, pH 8,0)

4) Inkubatu 37 °C-tan 30 minutuz, RNA tapatuta dago eta beheranzko aplikazioetarako prest dago.

2. 5′ terminala etiketatze erreakzioa (erreakzio bolumena: 20 μL)

Protokolo hau 5´ trifosfatoa duen RNA etiketatzeko diseinatuta dago eta eskariaren arabera eskala daiteke.Etiketa txertatzearen eraginkortasunari eragingo dio RNA-ren: GTP-ren molar erlazioak, baita RNA laginetako GTP-edukiari ere.

1) Konbinatu RNA eta Nukleasarik gabeko H2O kantitate egokia 1,5 ml-ko mikrofuge-hodi batean 14,0 µL-ko azken bolumenarekin.

2) Berotu 65 ℃-tan 5 minutuz eta ondoren izotz-bainua 5 minutuz.

3) Gehitu osagai hauek zehaztutako ordenan.

** GTP MIX GTP eta markatzaile kopuru txiki bati egiten dio erreferentzia.GTP-ren kontzentraziorako, erreferentzia3. oharrera.

4) Inkubatu 37 °C-tan 30 minutuz, RNA 5′ muturra etiketatuta dago eta beheranzko prest dago.

Aplikazioak

1. Itzulpen-saiaketak/in vitro itzulpenak egin baino lehen mRNA estaltzea

2. MRNAren 5´ amaierako etiketatzea

Erabilerari buruzko oharrak

1.RNAren disoluzioa Vaccinia Entzimarekin inkubatu aurretik berotzeak bigarren mailako egitura kentzen du transkripzioaren 5' amaieran.Luzatu denbora 60 minutura oso egituratuta dauden 5' amaiera ezagunak dituzten transkripzioetarako.

2. Erreakzio estaltzeko erabiltzen den RNA erabili aurretik purifikatu behar da eta nukleasarik gabeko uretan eseki.EDTA ez da egon behar eta disoluzioak gatzik gabe egon behar du.

3. 5´ muturra etiketatzeko, GTP kontzentrazio osoa erreakzioko mRNAren kontzentrazio molarra baino 1-3 aldiz handiagoa izan behar da.

4. Erreakzio-sistemaren bolumena gora edo behera eskala daiteke benetakoaren arabera.