Urazil DNA Glikosilasa
Uracil-DNA Glikosilasa (UNG edo UDG) 25 kDa-ko pisu molekularra duen E.coliren klon birkonbinatzailea da.Urazilo askearen askapena katalizatzen du kate bakarreko eta bikoitzeko DNA duten urazilotik, eta RNAren aurka inaktiboa da, eta PCR anplifikatzeko produktuen kutsadura saihesteko erabil daiteke.Ekintza-printzipioa PCR erreakzioan dUTP dTTP ordezkatzen bada eta dU baseak dituen PCR anplifikazio-produktu bat sortzen bada, entzimak U baseen lotura glikosidikoa hauts dezake kate bakarrean eta bikoitzean. DNA eta PCR anplifikazio-produktua degradatu.
Gomendatutako Aplikazioa
Kutsaduraren Prebentzioa Anplifikazioa
Biltegiratze-baldintza
-20 °C epe luzerako biltegiratzeko, ondo nahastu behar da erabili aurretik, saihestu maiz izoztea eta desizoztea.
Biltegiratze buffer
20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, Egonkortzailea, % 50 glizerola.
Unitatearen definizioa
DU baseak dituen kate bakarreko DNA 1 µg degradatzeko behar den entzima-kopurua 37 °C-tan ordubetean unitate 1 da.
Kalitate kontrola
1.SDS-PAGE garbitasun elektroforetikoa % 98 baino handiagoa
2.Anplifikazio-sentsibilitatea, lotez lote kontrola, egonkortasuna
3.UNG 1U 50 ℃-tan 2 minutuz tratatu ondoren, 103 kopiatik beherako U duen txantiloia guztiz degradatu behar da eta ezin da anplifikazio produkturik sortu.
4.Ez dago nukleasa jarduera exogenorik
Argibideak
| Osagaiak | Bolumena (μL) | Azken kontzentrazioa |
| 10 × PCR Buffer (dNTP librea, Mg²+doan) | 5 | 1× |
| dUTP (dCTP, dGTP, dATP) | - | 200 μM |
| dUTP (ordeztu dTTP) | - | 200-600 μM |
| 25 mM MgCl2 | 2-8 μL | 1-4 mM |
| 5 U/μL Taq | 0,25 | 1,25 U |
| 5 U/μL UNG | 0,25 (0,1-0,5) | 0,25 U (0,1-0,5) |
| 25 × Primer Mixa | 2 | 1× |
| Txantiloia | - | <1μg/erreakzioa |
| ddH₂O | 50era | - |
Ohar: a: qPCR/qRT-PCRrako erabiltzen bada, zunda fluoreszentea erreakzio sisteman gehitu behar da.Normalean, 0,2 μM-ko azken primer kontzentrazio batek emaitza onak eman ditzake;erreakzio-errendimendua eskasa denean, primer-kontzentrazioa 0,2-1 μM tartean doitu daiteke.Normalean, zundaren kontzentrazioa 0,1-0,3 μM bitarteko tartean optimizatzen da.Kontzentrazio-gradienteko esperimentuak egin daitezke primer eta zundaren konbinazio onena aurkitzeko.
Oharrak
1.UNG entzima kutsatutako dUTP anplifikazio produktuak PCR anplifikazio erreakzioaren aurretik erreakzio-sistematik kentzeko erabil daiteke, gero produktuaren kutsadura dela eta emaitza faltsu-positiboak saihesteko.
2.Kutsaduraren aurkako PCR erreakzioan erabiltzeko UNG entzimaren tenperatura optimoa 50 ℃ izaten da 2 minutuz;desaktibazio-baldintza 95 ℃ da 5 minutuz.
3.Saihestu maiz izozte-desizoztu, eta ez jarri tenperatura-aldaketa handirik.
4.Anplifikatu beharreko gene ezberdinek dUTP-ren erabilera-eraginkortasuna eta UNG entzimarekiko sentikortasuna dute, beraz, UNG sistemaren erabilerak detekzio-sentsibilitatea gutxitzen badu, erreakzio-sistema egokitu eta optimizatu behar da, laguntza teknikoa behar baduzu, jarri harremanetan. gure konpainia.
