RTL Alderantzizko Transkriptasa
RTL alderantzizko transkriptasa ARN txantiloiaren menpeko DNA polimerasa bat da, 3'→5' exonukleasa jarduerarik ez duena eta RNasa H jarduera duena.Entzima honek RNA erabil dezake txantiloi gisa DNAren kate osagarri bat sintetizatzeko, eta lehen katearen cDNA sintesian aplika daiteke, batez ere RT-LAMPerako (begizta bidezko anplifikazio isotermikoa).RTL alderantzizko transkriptasa 1.0arekin alderatuta, sentikortasuna nabarmen hobetzen da, egonkortasun termikoa indartsuagoa da eta 65 ° C-ko erreakzioa egonkorragoa da.RTL alderantzizko transkriptasa (glizerolarik gabekoa) prestakin liofilizatuak, RT-LAMP erreaktiboak liofilizatuak eta abar prestatzeko erabil daiteke.
Unitatearen definizioa
Unitate batek 1 nmol dTTP txertatzen du azidoz prezipita daitekeen materialan 20 minututan 50 °C-tan poly(A)•oligo(dT)25 txantiloi-primer gisa erabiliz.
Osagaiak
| Osagaia | HC5008A-01 | HC5008A-02 | HC5008A-03 |
| RTL Alderantzizko Transkriptasa (Glizerolarik gabekoa) (15U/μL) | 0,1 ml | 1 ml | 10 ml |
| 10×HC RTL Buffer | 1,5 ml | 4 × 1,5 ml | 5 × 10 ml |
| MgSO4 (100 mM) | 1,5 ml | 2 × 1,5 ml | 3 × 10 ml |
Biltegiratze-baldintza
Garraioa 0°C-tik behera eta -25°C~-15°C-tan gorde.
Kalitate kontrola
- Hondar-jardueraEndonukleasa:1 μg λDNA eta 15 RTL2.0 unitate dituen 50 μL-ko erreakzio batek 16 orduz 37 ℃-tan inkubatuta dituen kontrol negatiboen eredu bera erakusten du gel elektroforesiaren bidez.
- Hondar-jardueraExonukleasa:50 μL-ko erreakzio batek 1 μg digeritutako Hind Ⅲ λDNA eta 16 orduz 37 ℃-tan inkubatutako RTL2.0 15 unitate dituen kontrol negatiboaren eredu bera erakusten du gel elektroforesiaren bidez.
- Hondar-jardueraNickase:50 μL-ko erreakzio batek 1 μg supercoiled pBR322 eta 15 RTL2.0 unitate dituen 4 orduz 37 °C-tan inkubatuta, gel elektroforesiaren bidezko kontrol negatiboaren eredu bera erakusten du.
- Hondar-jardueraRNasa:0,48 μg MS2 RNA eta 15 RTL2.0 unitate dituen 10 μL-ko erreakzio batek 4 orduz 37 °C-tan inkubatutako kontrol negatiboaren eredu bera erakusten du gel elektroforesiaren bidez.
- E. coli gDNA:NeurtutaE.coliHCD detektatzeko kit espezifikoak, RTL2.0-ren 15 unitatek 1 baino gutxiago daukaE. coligenoma.
Erreakzioaren konfigurazioa
cDNA Sintesi Protokoloa
| Osagaiak | Bolumena |
| RNA txantiloia a | aukerakoa |
| Oligo(dT) 18~25(50uM) edo Random Primer nahasketa (60uM) | 2 μL |
| dNTP nahasketa (10 mM bakoitza) | 1 μL |
| RNasaren inhibitzailea (40U/uL) | 0,5 μL |
| RTL Alderantzizko Transkriptasa 2.0 (15U/uL) | 0,5 μL |
| 10×HC RTL Buffer | 2 μL |
| Nukleasarik gabeko ura | Gehienez 20 μL |
Oharrak:
1) RNA Totalaren dosia gomendatua 1ng ~ 1μg da
2) mRNAren dosia gomendatua 50ng ~ 100ng zen
Termoa-txirrindularitza errutina baterako baldintzak erreakzioa:
| Tenperatura (°C) | Denbora |
| 25 °Ca | 5min |
| 55 °C | 10minb |
| 80 °C | 10min |
Oharrak:
1) Random Primer Mix erabiltzen bada, inkubazio-urrats bat 25 °C-tan.
2) Helburuko primer nahasketa erabiltzen bada, inkubazio-urrats bat 55 °C-tan 10 ~ 30 minutuz.
RT-LAMP Protokoloa
| Osagaiak | Bolumena | Azken Kontzentrazioa |
| RNA txantiloia | aukerakoa | ≥10 kopia |
| dNTP nahasketa (10 mM) | 3,5 μL | 1,4 mM |
| FIP/BIP lehengaiak (25×) | 1 μL | 1,6 μM |
| F3/B3 lehengaiak (25×) | 1 μL | 0,2 μM |
| LoopF/LoopB lehengaiak (25×) | 1 μL | 0,4 μM |
| RNasaren inhibitzailea (40U/μL) | 0,5 μL | 20 U/Ereakzioa |
| RTL Alderantzizko Transkriptasa 2.0 (15U/μL) | 0,5 μL | 7,5 U/Erreakzioa |
| Bst V2 DNA polimerasa (8U/μL) | 1 μL | 8 U/Erreakzioa |
| MgSO4 (100 mM) | 1,5 μL | 6 mM (guztira 8 mM) |
| 10×HC RTL Buffer (edo 10×HC Bst V2 Buffer) | 2,5 μL | 1 × (2 mM Mg2+) |
| Nukleasarik gabeko ura | Gehienez 25 μL | - |
Oharrak:
1) Nahastu zurrunbiloarekin eta zentrifugatu laburki biltzeko.Tenperatura etengabeko inkubazioa 65 °C-tan ordubetez.
2) Bi buffer elkarreragingarriak dira eta konposizio bera dute.
Oharrak
1.Produktu honek solido zuri bat osatuko du -20 °C-tan gordetzen denean.Atera -20°C-tik eta izotz gainean jarri 10 bat minutuz.Urtu ondoren, astinduz eta nahastuz erabil daiteke.
2.cDNA produktua -20 °C edo -80 °C-tan gorde daiteke edo berehala erabil daiteke PCR erreakziorako.
3.RNasen kutsadura saihesteko, mantendu esperimentu-eremua garbi, eta erabili eskularru eta maskarak garbiak funtzionatzen duten bitartean.
