Proteinasa K (likidoa)
Katuaren zenbakia: HC4502A
K proteinasa serina proteasa egonkorra da, substratuaren espezifikotasun handia duena.Jatorrizko egoeran proteina asko degradatzen ditu detergenteen presentzian ere.Kristalen eta egitura molekularren ikerketen frogak adierazten du entzima subtilisinaren familiakoa dela, gune aktiboko hirukote katalitiko batekin (Asp39-Haren69- Ser224).Zatiketa gune nagusiena alfa amino talde blokeatuak dituzten aminoazido alifatiko eta aromatikoen karboxilo taldearen ondoan dagoen lotura peptidikoa da.Bere zabalerako erabiltzen da normaleanespezifikotasuna.
Zehaztapena
| Itxura | Likido koloregabetik marroi argira |
| Jarduera | ≥800 U/ml |
| Proteinen kontzentrazioa | ≥20 mg/ml |
| DNasa | Ez da bat ere detektatu |
| RNasa | Ez da bat ere detektatu |
Biltegiratzeko baldintzak
Gorde 2-8 ℃-ko tenperaturan.
Propietateak
| EC zenbakia | 3.4.21.64 (RTritirachium albumeko ekombinatzailea) |
| Pisu molekularra | 29 kDa (SDS-PAGE) |
| Puntu isoelektrikoa | 7.81 |
| pH optimoa | 7,0-12,0 1. irudia |
| Tenperatura optimoa | 65 ℃ 2. irudia |
| pH-aren egonkortasuna | pH 4,5-12,5 (25℃, 16 h) 3. irudia |
| Egonkortasun termikoa | 50℃-tik behera (pH 8,0, 30 min) 4. irudia |
| Aktibatzaileak | SDS, urea |
| Inhibitzaileak | Diisopropil fluorofosfatoa;fenilmetilsulfonil fluoruroa |
Aplikazioak
1. Diagnostiko genetikoa egiteko kit
2. RNA eta DNA erauzteko kitak
3. Ehunetatik proteinak ez diren osagaiak erauztea, proteina-ezpurutasunak degradatzea, hala nola DNAren txertoak eta heparina prestatzea.
4. ADN kromosomaren prestaketa pultsatuko elektroforesiaren bidez
5. Western blot
6. Albumina glikosilatuen erreaktibo entzimatikoak in vitro diagnostikoa
Neurriak
Erabili edo pisatzen duzunean babes eskularruak eta betaurrekoak erabili, eta ondo aireztatuta erabili ondoren.Produktu honek larruazaleko erreakzio alergikoak eta begietako narritadura larriak sor ditzake.Arnastuz gero, alergia edo asma sintomak edo disnea sor ditzake.Arnas narritadura eragin dezake.
Saiakera
Unitatearen definizioa
Unitate bat (U) honako baldintza hauetan kaseina hidrolizatzeko 1 μmol tirosina minutuko ekoizteko behar den entzima-kantitatea bezala definitzen da.
Erreaktiboak prestatzea
I erreaktiboa: 1 g esne kaseina 0,1 M sodio fosfato disoluzioko 50 ml-tan disolbatu zen (pH 8,0), 65-70 ℃ uretan inkubatu 15 minutuz, irabiatu eta disolbatu, urarekin hoztu, sodio hidroxidoarekin pH 8,0ra egokitu eta finkatu. bolumena 100 ml.
II erreaktiboa: TCA disoluzioa: 0.1M azido trikloroacetikoa, 0.2M sodio azetatoa, 0.3M azido azetikoa.
III erreaktiboa: 0,4M Na2CO3irtenbidea.
IV erreaktiboa: forint erreaktiboa ur puruz diluitua 5 aldiz.
V erreaktiboa: entzimaren diluitzailea: 0,1M sodio fosfato disoluzioa (pH 8,0).
VI erreaktiboa: Tirosina disoluzioa: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol/ml tirosina 0,2M HCl-rekin disolbatuta.
Prozedura
1. 0,5 ml I erreaktiboa aurrez berotzen da 37 ℃-ra, gehitu 0,5 ml entzima-soluzio, ondo nahastu eta 37 ℃-tan inkubatu 10 minutuz.
2. Gehitu 1 ml erreaktibo II erreakzioa gelditzeko, ondo nahastu eta inkubazioa jarraitu 30min.
3. Zentrifugatu erreakzio-disoluzioa.
4. Hartu 0,5 ml gainditzailea, gehitu 2,5 ml III erreaktiboa, 0,5 ml IV erreaktiboa, ondo nahastu eta inkubatu 37 ℃-tan 30 minutuz.
5. OD660OD gisa zehaztu zen1;kontrol talde hutsa: 0,5 ml V erreaktiboa erabiltzen da entzimaren soluzioa ordezkatzeko OD zehazteko660OD bezala2, ΔOD=OD1-OD2.
6. L-tirosina kurba estandarra: 0,5 ml-ko kontzentrazio ezberdineko L-tirosina disoluzioa, 2,5 ml III erreaktiboa, 0,5 ml IV erreaktiboa 5 ml zentrifuga-hodi batean, inkubatu 37 ℃-tan 30 minutuz, OD detektatu.660L-tirosinaren kontzentrazio desberdinetarako, ondoren Y=kX+b kurba estandarra lortu da, non Y L-tirosinaren kontzentrazioa den, X OD den600.
Kalkulua
2: erreakzio-disoluzioaren bolumen osoa (mL)
0,5: entzimaren disoluzioaren bolumena (mL)
0,5: determinazio kromogenikoan erabilitako erreakzio likidoaren bolumena (mL)
10: Erreakzio denbora (min)
Df: Diluzio anitza
C: Entzimaren kontzentrazioa (mg/mL)
Erreferentziak
1. Wieger U & Hilz H. FEBS Lett.(1972);23:77.
2. Wieger U & Hilz H. Biochem.Biofisikoa.Erres.Komunik.(1971);44:513.
3. Hilz, H.et al.,Euro.J. Biokimika.(1975);56: 103–108.
4. Sambrook Jet al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. edizioa, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989).
Zifrak
irudia. 1 Optimoa pH
100mM tampon-disoluzioa: pH6,0-8,0, Na-fosfatoa;pH8,0- 9,0, Tris-HCl;pH 9,0-12,5, Glizina-NaOH. Entzimaren kontzentrazioa: 1 mg/mL
2. irudia Tenperatura optimoa
Erreakzioa 20 mM K-fosfato tamponean pH 8,0.Entzimaren kontzentrazioa: 1 mg/mL
3. irudia pH Egonkortasuna
25 ℃, 16 h-tratamendua 50 mM buffer soluzioarekin: pH 4,5-5,5, azetatoa;pH 6,0-8,0, Na-fosfatoa;pH 8,0-9,0, Tris-HCl.pH 9,0-12,5, Glizina-NaOH.Entzimaren kontzentrazioa: 1 mg/mL
4. irudia Termikoa egonkortasuna
30 minutuko tratamendua 50 mM Tris-HCl tamponarekin, pH 8,0.Entzimaren kontzentrazioa: 1 mg/mL
5. irudia Biltegiratzea egonkorraty at 25℃
