Landare zuzeneko PCR Kit
Katuaren zenbakia: HCR2020A
Plant Direct PCR Kit egokia da landareen hostoak, haziak eta abar zuzenean anplifikatzeko, eta polisakaridorik eta polifenolik ez duten landare-laginak errendimendu handiko baheketarako erabil daiteke.Eboluzio zuzenduan oinarritutako anplifikazio zuzeneko DNA polimerasak tolerantzia handiagoa du landareetan PCR inhibitzaileekiko.Bitartean, anplifikazio-errendimendu handia mantentzen du, 5 kb barruko DNA zatiak anplifikatzeko egokia dena.Kitko A Lysis buffer berezia landare-ehun freskoak edo izoztuak lisatzeko erabil daiteke.Erraza da funtzionatzen eta lisatua anplifikaziorako txantiloi gisa erabil daiteke, garbiketarik gabe.Sistemak babes-agenteak ditu, lagin gordinak behin eta berriz izoztu eta desizoztu ondoren eraginkortasunez anplifikatzea ahalbidetzen dutenak.2 × Plant Direct Master Mix lehengaiak eta txantiloiak gehitu behar ditu anplifikazio-erreakzioa egiteko, eta horrela pipetatze-eragiketak murrizten dira eta detekzio-erritmoa eta emaitzen erreproduzigarritasuna hobetu.
Osagaiak
| Osagaiak | 50 RXNS | 200 RXNS |
| 2 × Landare Zuzeneko Master Mix | 1,25 ml | 4×1,25 ml |
| Landareen Lisi Zuzeneko Buffer A | 5 ml | 20 ml |
| Landareen Lisi Zuzeneko Buffer B* | 5 ml | 20 ml |
*Plant Direct Lysis Buffer B aukerako erreaktibo bat da, Landareen Direct Lysis Buffer A neutralizatzeko erabiltzen dena laginak biltegiratzeko denbora luzatzeko.Benetako egoeraren arabera erabil daiteke.
Biltegiratzeko baldintzak
2 × Landare Zuzeneko Master Mix, gorde -30 ~ -15 ℃ eta saihestu behin eta berriz izozteak eta desizozteak;Landare Zuzeneko Lisis Buffer, gorde -30 ~ -15 ℃ edo 2 ~ 8 ℃.
Esperimentu Prozesua
Laginaren tratamendua–Landare hostoa
Metodo zuzena:Hosto gazteak erabiltzea gomendatzen da.Erabili 0,5 – 3 mm-ko diametro finkoko zulo-zulo bat lagin txiki eta uniforme bat lortzeko, eta, ondoren, zuzenean gehitu lagina PCR sistemara (50 μl sistema gomendatzen da).Kontuan izan, ziurtatu lagina PCR soluzioan dagoela eta ez hodiaren hormaren kontra.Zati luzeak eta lagin konplexuak anplifikatzeko PCR zuzena erabiltzen bada, txantiloi gisa diametro txikiagoa duen lagina (0,5 – 1 mm) erabiltzeak emaitza hobeak lortzen lagun dezake.
Artezketa lisi metodoa:Hosto gazteak erabiltzea gomendatzen da.Hartu hosto zati txiki bat (1-3 mm inguruko diametroa), jarri 20 μl Plant Direct Lysis Buffer Ab-en, eta xehatu ahal den neurrian (urrats hau hostoa 100 μl pipeta-puntarekin estutuz egin daiteke. lagina birrintzeko) .Hosto-ehun bolumen handiagoak erabiltzen badira (ez izan 7 mm baino gehiago), handitu diluzio-buffer-aren bolumena 50 μl-ra.Hostoak xehatu ondoren, soluzioa berdea agertu behar da.Zentrifugazio labur baten ondoren, gehitu gainnadantearen 1 μl PCR sistemara erreakzio txantiloi gisa.
Lisi termikoaren metodoa:Hosto gazteak erabiltzea gomendatzen da.Hartu hosto zati txiki bat (1 – 3 mm inguruko diametroa), jarri 20 μl Landare Lisis Zuzeneko Buffer A-tan, eta berotu 95°C-tan 5 – 10 min.Lisiaren denbora behar bezala luzatu daiteke lisatzeko zailak diren hostoentzat (20 min baino gehiago).Hosto-ehun bolumen handiagoak erabiltzen badira (ez izan 7 mm baino gehiago), handitu diluzio-buffer-aren bolumena 50 μl-ra.Berotu ondoren, zentrifugatu labur, eta gehitu 1 μl gainditzaile PCR sistemari erreakzio txantiloi gisab.
Laginaren tratamendua– Landare Hazia
Artezketa lisi metodoa:Erabili bisturia 5 mm-ko diametroa duten haziak mozteko, gehitu 100 μl Plant Direct Lysis Buffer A-ri eta lagina xehatu pipeta-puntarekin edo beste tresna batekin.Zurrunbilo labur bat eta utzi giro-tenperaturan 3-5 minutuz.Ziurtatu hazi-lagina diluzio-bufferean murgilduta dagoela.Zentrifugazio labur baten ondoren, gehitu gainnadantearen 1 μl PCR sistemara erreakzio txantiloi gisa.
Lisi termikoaren metodoa:Erabili bisturia 5 mm-ko diametroa duten haziak mozteko, gehitu Landareen Lisis Zuzeneko Buffer A 100 μl-ri eta berotu 95 °C-tan 5-10 min.Lisiaren denbora behar bezala luzatu daiteke lisatzeko zailak diren hostoentzat (30 min baino gehiago).Berotu ondoren, zentrifugatu labur, eta gehitu 1 μl gainditzailea PCR sistemara erreakzio txantiloi gisab.
a.Guraizeak edo bestelako tresnak ere erabil daitezke tamaina egokiko laginak mozteko;puntzoia edo guraizeak berrerabiltzen badira, sodio hipokloritoaren %2ko disoluzioarekin garbitu beharko dira erabili aurretik, laginen arteko kutsadura gurutzatua saihesteko.
b.Ziurtatu Landare Zuzeneko Lisis Buffera guztiz urtuta dagoela erabili aurretik.Buffer likatsua bada edo prezipitatuak baditu, 37 ℃-tan berotu daiteke guztiz urtzeko erabili aurretik.
c.Erreakzio-sistemako txantiloiaren bolumena egoki egokitu daiteke gehitutako landare-materialaren eta diluitzailearen bolumenaren diferentziaren arabera.
Landareen Lisi Zuzeneko Buffer
Landareen Direct Lysis Buffer A produktu honetan zorrozki optimizatu da landare-ehun gehienen genoma askatzeko eta landare gordinak 4 ℃-tan epe laburrean gordetzeko egokia da.Lagina denbora luzeagoan gorde behar bada (adibidez, 1-2 hilabetez), gainnadantea EP hodi berri batera transferitzea eta -20 ℃-tan gordetzea gomendatzen da.Laginak modu egonkorragoan gordetzeko, gehitu Plant Direct Lysis Buffer B bolumen berdina transferitutako gainnatzaileari, ondo nahastu eta gorde -20 ℃-tan.Biltegiratze-denbora egonkorra landareen lagin eta egoeraren arabera aldatzen da.
Erreakzio-sistema
| ddH2O | 20,0 µl arte | 50,0 µl arte |
| 2 × Landare Zuzeneko Master Mixa | 10,0 µl | 25,0 µ |
| Primer 1 (10 µM) | 0,8 µl | 2,0 µl |
| Primer 2 (10 µM)b | 0,8 µl | 2,0 µl |
| Landare-hosto/estraktu gordinaren lagina(Ikusi Laginak prozesatzeko) | 0,5 – 3 mm-ko hosto-disko/x µl | 0,5 – 3 mm-ko hosto-disko/x µl |
a.Mg dauka2+2 mM-ko azken kontzentrazioan.
b.Primer bakoitzeko 0,4μM-ko azken kontzentrazioa erabiltzea gomendatzen da.Primerak gehiegi erabiltzeak anplifikazio ez-espezifikoa areagotuko du.
c.Erabilitako lagin kopurua benetako egoeraren arabera egokitu daiteke.Lisatutako lagin gordinaren erreakzio bakarrean erabiltzen den kopurua erreakzioaren bolumen osoaren % 2 - % 20 artean doitu daiteke.Lagin gehiegi erabiltzeak anplifikazio-porrota eragin dezake.
Erreakzio Programa
| Urratsak | Tenperatura | Denbora |
| Hasierako Desnaturalizazioa | 98℃ | 5 min |
| Desnaturalizazioa | 95℃ | 10 seg |
| Ontzea | 58 ~ 72 ℃ | 15 seg |
| Luzapena | 72 ℃ | 30 seg |
| Azken Luzapena | 72 ℃ | 5 min |
a.Hasierako Desnaturalizazioak (98 ℃, 5 min) landare-ehunen lisia sustatzen du, PCR anplifikaziorako erabil daitekeen DNA genomikoa askatuz.Ez laburtu denbora edo tenperatura jaitsi.
b.Primer Tm balioaren berdina edo Tm balioa baino 2 ~ 4℃ handiagoa ezartzea gomendatzen da.Produktu honetan erabiltzen den zuzeneko anplifikazioko DNA polimerasa Taq DNA polimerasa konbentzionaletik desberdina da, eta erreakzio-erreakzio-tenperaturarako baldintza bereziak ditu; erreakzio-tenperatura altua erabiltzeak anplifikazio ez-espezifikoa modu eraginkorrean murrizten du eta anplifikazio-eraginkortasuna hobetu dezake.Txantiloi konplexuetarako, anplifikazio eraginkorra lor daiteke erretilu tenperatura egokituz eta luzapen-denbora luzatuz.
c.Anplifikazio-produktuaren luzera ≤1 kb bada, luzapen-denbora 30 seg/kb-an ezartzen da;Anplifikazio-produktuaren luzera > 1 kb bada, luzapen-denbora 60 seg/kb-an ezartzen da.
d.Lagin konplexuetarako edo anplifikazio etekin baxua duten laginetarako, ziklo-kopurua egoki handitu daiteke 40-50 zikloraino.
Aplikazioak
Landare-ehunen zuzeneko anplifikaziorako eta polisakaridorik eta polifenolik ez duten landare-laginen errendimendu handiko baheketa egiteko aplikagarria da.
Oharrak
Ikerketa erabiltzeko soilik.Ez da diagnostiko-prozeduretan erabiltzeko.
1. Landare gordinaren anplifikaziorako edo zuzeneko anplifikaziorako, esperimentuari ekin aurretik DNA genomiko araztua kontrol positibo gisa erabiltzea gomendatzen da, sistema, abiarazleak eta eragiketak zuzenak direla ziurtatzeko.
2. Kit honetan erabiltzen den zuzeneko anplifikazioko DNA polimerasak zuzenketa-jarduera handia du.TA klonazioa egin behar bada, adenina gehitu aurretik ADNa arazteko gomendatzen da.
3. Lehen diseinurako orientabidea:
a.Primeraren 3′ amaierako azken oinarria G edo C izatea gomendatzen da.
b.Segidako desadostasunak saihestu behar dira lehen 3' amaierako azken 8 oinarrietan.c.Saihestu ile-hornaren egiturak inprimagailuaren 3′ amaieran.
d.Aurrerako primeraren eta alderantzizko hasierako Tm balioaren desberdintasunak 1 ℃ baino gehiago izan behar dira eta Tm balioa 60 ~ 72 ℃ra egokitu behar da (Primer Premier 5 gomendatzen da Tm balioa kalkulatzeko).
e.Txantiloiarekin bat ez datozen abiarazte-sekuentzia gehigarriak ez dira sartu behar Tm balioa kalkulatzean.
f.Primeraren GC edukia % 40-60koa izatea gomendatzen da.
g.Primeran A, G, C eta T-en banaketa orokorra ahalik eta berdinena izan behar da.Saihestu GC edo AT eduki handia duten eskualdeak erabiltzea.
h.Saihestu 5 base edo gehiagoko sekuentzia osagarriak agerpenaren barruan edo bi abiarazteren artean eta saihestu 3 base edo gehiagoko sekuentzia osagarriak bi abiarazleen 3′ amaieran.
i.Erabili NCBI BLAST funtzioa abiaraztearen espezifikotasuna egiaztatzeko, anplifikazio ez-espezifikoa saihesteko.
