DNA Erauzteko Mini Kit
Kit honek buffer sistema optimizatua eta silize gelaren zutabeen arazketa teknologia hartzen ditu, 70 bp – 20 kb DNA zatiak TAE edo TBE agarosa gelaren kontzentrazio ezberdinetatik berreskura ditzaketenak.DNA xurgatzeko zutabeak bereziki adsorbatu dezake DNA gatz handiko egoeran.Horrez gain, kitak PCR produktuetatik, erreakzio entzimatiko-sistemetatik edo beste metodo batzuen bidez lortutako DNA-produktu gordinak zuzenean purifikatu ditzake DNA zatiak, eta ezpurutasunak kendu ditzake, hala nola proteinak, beste konposatu organiko batzuk, gatz ioi inorganikoak eta oligonukleotidoen lehengaiak.Arazketa 10-15 minutuko epean amaitu daitekeela ziurtatu dezake.Araztutako DNA zuzenean lotzeko, eraldaketa, entzimak digestioa, in vitro transkripzioa, PCR, sekuentziazioa, mikroinjekzioa, etab.
Biltegiratzeko baldintzak
Gorde -15 ~ -25 ℃ eta garraiatu giro-tenperaturan.
Osagaiak
| Osagaiak | (100 rxns) |
| Buffer BPG | 80 ml |
| Buffer GW | 2 × 20 ml |
| Eluzio Buffer | 20 ml |
| FastPure DNA Mini Columns-G | 100 |
Buffer BPG:DNA lotzeko buffer.
Buffer GW:Garbiketa buffer;gehitu etanol absolutua botilan adierazitako bolumenaren arabera erabili aurretik.
Eluzio Buffer:Eluzioa.
FastPure DNA Mini Columns-G:DNA xurgatzeko zutabeak.
Bilketa Hodiak 2 ml:Iragazkia biltzeko hodiak.
Prestatutako materialak
1,5 ml esterilizatutako hodiak, etanol absolutua eta isopropanola (ADN zatia ≤100 bp denean, gehitu bolumen bat
isopropanol bolumen 1 gel), bainu ur.
Esperimentu Prozesua
Gehitu 80 ml etanol Buffer GW diluitzeko etiketan adierazitako moduan erabili aurretik, gorde giro-tenperaturan.
Mekanismoa
1. PCR erreakzio-soluzioa
Gela erauzteko eskema: Gehitu bolumen berdina Buffer BPG PCR erreakzio-soluzioa berreskuratzeko eskema:Gehitu 5 aldiz bolumena Buffer
2. BPG Kalkulatu gelaren bolumena (100 μl 100 mg da)
Gela disolbatu
3. Aurrez berotu 50 ~ 55℃
4. Bind Wash
Gehitu 300 μL Buffer BPG*
Gehitu 700 μL Buffer GW
Gehitu 700 μL Buffer GW
5. Elute
Gehitu 20 – 30μL Elution Buffer edo ur desionizatua
Oharrak* PCR erreakzio fluidoa berreskuratzea urrats hau gabe
Gela erauzteko programa
1. DNA zatiak zatikatzeko DNA elektroforesiaren ondoren, kendu agarosa gelaren DNA zatiaren marra bakarra UV argiaren azpian.Paper xurgatzailea erabiltzea gomendatzen da gelaren itxurazko hezetasuna xurgatzeko eta gelaren xerraren tamaina minimizatzeko ahalik eta agarosa gehigarria kenduz.Pisatu gel-xerra (mikrozentrifuga-hodirik gabe) bere bolumena kalkulatzeko: 100 mg-ko gel-xerren bolumena 100 μL da gutxi gorabehera, dentsitatea 1g/ml dela suposatuz.
2. Gehitu bolumen berdina Buffer GDP, inkubatu 50 ~ 55 ℃-tan 7-10 minutuz (gelaren tamainaren arabera, egokitu inkubazio denbora gela guztiz disolbatu arte).Inkubazioan zehar hodia 2 aldiz itzuli.
Δ Buffer BPGren 1-3 bolumen gehitzeak ez du DNA berreskuratzeko eraginkortasunean eragingo.Berreskuratu nahi den DNA zatia <100 bp-a bada, Buffer BPGaren 3 bolumen gehitu behar dira;gel-xerra guztiz disolbatu denean, gehitu isopropanol bolumen 1 eta ondo nahastu, eta jarraitu hurrengo urratsera.
3. Zentrifugatu labur lagina hodiaren hondora eramateko, sartu FastPure DNA Mini Columns-G 2 ml-ko bilketa-hodietan, arretaz transferitu disoluzioa gehienez 700 μL-koa behin behin.
iragazketa-zutabeetara arte, zentrifugatu 12.000 rpm-an (13.800 X g) 30-60 segunduz.
4. Iragazkia baztertu eta 300 μL Buffer GDP zutabean gehitu, giro-tenperaturan inkubatu 1 minutuz, zentrifugatu 12.000 rpm-an (13.800 X g) 30-60 segundoz.
5. Iragazkia baztertu eta Buffer GW 700 μL gehitu (egiaztatu aldez aurretik etanol absolutua gehitu den!) zutabean, zentrifugatu 12.000 rpm-an (13.800 X g) 30-60 segundoz.
Δ Mesedez, gehitu Buffer GW adsortzio-zutabearen hormaren inguruan, edo gehitu Buffer GW atzeko estalkia eta nahastu goitik behera 2-3 aldiz, hodiaren horman itsatsitako gatza guztiz garbitzen laguntzeko.
6. Errepikatu 5. urratsa.
Δ Buffer GW-arekin birritan garbitzeak gatza guztiz kentzen dela bermatu dezake eta ondorengo esperimentuetan eragina ezabatzen du.
7. Iragazkia bota eta zutabe hutsa zentrifugatu 12.000 rpm-an (13.800 X g) 2 min.
8. Sartu zutabea 1,5 ml-ko mikrozentrifuga-hodi garbi batean, gehitu 20 - 30 μL Elution Buffer zutabe-mintzaren erdigunean, inkubatu 2 minutuz, eta ondoren zentrifugatu 12.000 rpm-an (13.800 X g) 1 min.Baztertu zutabea, gorde lortutako DNA -20-tan.
Δ 8. urratseko gainditzailea zutabera transferitzea berriro elutzeko eta Elution Buffer-a 55-era aldez aurretik berotzea (DNA zatia > 3 kb denean) lagungarria izan daiteke berreskuratzeko eraginkortasuna areagotzeko.
PCR produktuak berreskuratzeko programa
Protokolo hau aplikagarria da PCR produktuetatik, erreakzio entzimatiko sistematik eta beste DNA produktu gordinak (DNA genetikoa barne) DNA zatiak arazteko.Soluzio honek hainbat nukleotido, abiarazle, lehen dimero, gatz molekulak, entzimak eta beste ezpurutasun batzuk modu eraginkorrean ken ditzake.
1. Zentrifugatu laburki PCR produktuak, erreakzio entzimatikoen soluzioa eta beste DNA gordinak.Kalkulatu haien bolumena pipetarekin eta transferitu 1,5 ml edo 2 ml esterilizatutako tutu batera.Gehitu ddH2O bolumena 100 μL arte;kontzentrazio handiko DNA genomikoaren kasuan, berriz, 300 μL-ra diluitzeak ddH2O-rekin berreskuratzeko eraginkortasuna hobetzen lagunduko du.
2. Gehitu Buffer BPGren 5 bolumen, ondo nahastu alderantziz edo zurrunbilo eginez.Interesgarria den DNA zatia > 100 bp bada, 1,5 bolumen gehiago (laginak + Buffer BPG) etanol gehitu behar dira.
3. Sartu zutabea berriro bilketa-hodian, transferitu nahasketa zutabera, zentrifugatu 12.000 rpm-an (13.800 ×g) 30-60 segundoz.Nahastutako disoluzioaren bolumena > 700 µL bada, sartu berriro adsortzio-zutabea bilketa-hodian, transferitu gainerako disoluzioa adsortzio-zutabera eta zentrifugatu 12.000 rpm-an (13.800 × g) 30-60 segundoz.
4. Hurrengo emanaldiak 08- 1/Gel erauzketa programaren 5 – 8 urratsari egiten dio erreferentzia.
Aplikazioak
TAE edo TBE agarosa gelaren hainbat kontzentrazio;PCR produktuak, erreakzio entzimatiko-sistemak edo hainbat metodoren bidez lortutako beste DNA-produktu gordinak.Berreskuratutako zatiak bitartekoak ziren70 bp -20 kb.
Oharrak
Ikerketa erabiltzeko soilik.Ez da diagnostiko-prozeduretan erabiltzeko.
1. Gehitu 80 ml etanol Buffer GW diluitzeko etiketan adierazitako moduan erabili aurretik, gorde giro-tenperaturan.
2. Buffer BPGa tenperatura baxuko biltegiratzean hauspeatzen erraza bada, giro-tenperaturan jar daiteke denbora tarte batez erabili aurretik.Beharrezkoa izanez gero, 37 ℃-ko ur-bainu batean berotu daiteke prezipitatua guztiz disolbatu arte, eta gero nahastu ondoren erabil daiteke.
3. Ezarri ur-bainuaren tenperatura 50 ~ 55 ℃ aldez aurretik.
4. 08-1/Gel erauzketa programaren 1. urratsean, gel-xerren tamaina minimizatzeak nabarmen murriztuko du disolbatze-denbora eta berreskuratzeko eraginkortasuna areagotzen du (DNA linealizatua erraz hidrolizatzen da tenperatura altuan etengabe jasaten denean).Ez ezazu DNA gela UVra denbora luzez busti, argi ultramoreak DNA kaltetu dezake eta.
5. Gela disolbatu 08- 1/Gel erauzketa programaren 2. urratsean erabat, bestela DNA berreskuratzeko eraginkortasuna larriki kaltetuta egongo da.
6. Aurrez berotu Elution Buffer edo ddH2O 55 ℃-ra, eta hori lagungarria da DNA eluzioaren eraginkortasuna hobetzeko.Gomendatzen da DNA 2,5 mM Tris-HCl-ko eluantean gordetzea, pH 7,0 - 8,5.
