M-MLV Alderantzizko Transkriptasa
RevScript Alderantzizko transkriptasa ingeniaritza genetikoaren teknologiaren bidez lortzen da.cDNA sintesi ahalmen handiagoa du, egonkortasun termikoa eta erreakzio-tenperatura muga (60 °C arte).Sintetizatutako cDNA produktua 10 kb-koa da.Txantiloien afinitatea hobetzen du eta bigarren mailako egitura konplexua edo kopia baxuko geneak dituzten RNA txantiloien alderantzizko transkripzioa egiteko egokia da.
Osagaiak
| Osagaia | HC2003B (10.000U) | HC2003B (5*10.000U) | HC2003B (200.000U) |
| RevScript Alderantzizko Transkriptasa (200U/μL) | 50 μL | 5×50 μL | 1 ml |
| 5 × RevScript Buffer | 250 μL | 1,25 ml | 5 ml |
Biltegiratze-baldintza
Produktu hau -25°C~-15°C-tan gorde behar da 2 urtez.
Unitatearen definizioa
Unitate batek 1 nmol dTTP sartzen ditu azidoan disolbaezin den materialan 10 minututan 37 °C-tan Oligo(dT) lehengai gisa erabiliz.
Erreakzioaren konfigurazioa
1.RNA txantiloiaren desnaturalizazioa (Urrats hau hautazkoa da, RNA txantiloiaren desnaturalizazioak bigarren mailako egiturak irekitzen laguntzen du, eta horrek lehen katearen cDNAren etekina hobetuko du).
| Osagaiak | Bolumena (μL) |
| RNasik gabeko ddH2O | 13ra arte |
| Oligo(dT)18 (50 μmol/L) edo Random Primer (50 μmol/L) Edo Gene Espezifikoak (2 μmol/L) | 1 |
| edo 1 | |
| edo 1 | |
| RNA txantiloia | X a |
Oharrak:
1) a: RNA osoa: 1-5 ug edo mRNA: 1-500 ng
2) 65 °C-tan inkubatzea 5 minutuz, gero izotz gainean transferitu berehala 2 minutuz hozteko.Zentrifugazio laburra erreakzio-likidoa biltzeko, gehitu alderantzizko transkripzioaren erreakzioaren soluzioa hurrengo taulan agertzen den moduan.Pipetta poliki-poliki nahasteko.
1.Erreakzio-nahastearen prestaketa (20 μL bolumena)
| Osagaiak | Bolumena (μL) |
| Aurreko urratsaren nahasketa | 13 |
| 5×Buffer | 4 |
| dNTP nahasketa (10 nmol/L) | 1 |
| Alderantzizko transkriptasa (200 U/μL) | 1 |
| RNasaren inhibitzailea (40 U/μL) | 1 |
1.Egin erreakzioa baldintza hauetan:
| Tenperatura (°C) | Denbora |
| 25 °Ca | 5min |
| 42 °Cb | 15-30min |
| 85 °Cc | 5min |
Oharrak:
1) a.25 °C-tan inkubatzea 5 minutuz ausazko hexameroak erabiltzeko soilik behar da.Mesedez, saltatu urrats hau Oligo (dT) erabiltzen duzunean18edo Gene Specific Primer.
2) b.Gomendatutako alderantzizko transkripzio-tenperatura 42 °C da, bigarren mailako egitura konplikatuak edo GC eduki handia duten txantiloietarako, erreakzio-tenperatura 50-55 °C-ra igotzea gomendatzen da.
3) c.85 °C-tan berotzea 5 minutuz alderantzizko transkriptasa desaktibatzeko.
4) Produktua zuzenean erabil daiteke PCR edo qPCR erreakzioetan, edo -20 °C-tan gorde daiteke epe laburreko biltegiratzeko.Produktuak aliguot eta -80 °C-tan gordetzea gomendatzen da epe luzerako gordetzeko.Saihestu maiz izozte-desizoztea.
5) Produktua urrats bakarreko RT-qPCRrako egokia da, 25μL erreakzio-sistema bakoitzeko 10-20 U alderantzizko transkriptasa gehitzea gomendatzen da edo pixkanaka alderantzizko transkriptasa kopurua handitzea benetako egoeraren arabera.
Oharrak
1.Mesedez, eduki esperimentu-eremua garbi;Eskularru garbiak eta maskarak erabili behar dira funtzionatzerakoan.Esperimentuan erabilitako kontsumigarri guztiek RNasik gabekoak izan behar dute RNasa kutsatzea saihesteko.
2.Prozedura guztiak izotzetan egin behar dira RNA degradazioa saihesteko.
3.Kalitate handiko RNA laginak gomendatzen dira alderantzizko transkripzioaren eraginkortasun handia bermatzeko.
4.Produktu hau ikerketarako soilik da.
5.Mesedez, funtzionatu laborategiko batekin eta botatzeko eskularruekin, zure segurtasunerako.
