M-MLV Neoscript Reverse Transcriptase
Neoscript Reverse Transcriptase Moloney murine leuzemia birusaren jatorria eta adierazpena E.colin M-MLV genearen mutazio-baheketaz lortutako alderantzizko transkriptasa bat da.Entzimak RNasa H jarduera kentzen du, tenperatura tolerantzia handiagoa du eta tenperatura altuko alderantzizko transkripziorako egokia da.Hori dela eta, lagungarria da RNAren goi-mailako egituraren eta faktore ez-espezifikoak cDNA sintesiaren eragin kaltegarriak kentzeko, eta egonkortasun handiagoa eta alderantzizko transkripzio-sintesirako gaitasun handiagoa du.Entzimak egonkortasun handiagoa eta alderantzizko transkripzioaren sintesi ahalmena du.
Osagaiak
1.200 U/μL Neoscript Alderantzizko Transkriptasa
2.5 × First-Strand Buffer (aukerakoa)
* 5 × First-Strand Buffer-ek ez du dNTPrik, gehitu dNTPak erreakzio-sistema prestatzerakoan
Gomendatutako Aplikazioa
1.Urrats bakarreko qRT-PCR.
2.RNA birusa detektatzea.
Biltegiratze-baldintza
-20 °C epe luzerako biltegiratzeko, ondo nahastu behar da erabili aurretik, saihestu maiz izoztea eta desizoztea.
Unitatearen definizioa
Unitate batek 1 nmol dTTP sartzen ditu 10 minututan 37 °C-tan, poli(A)•oligo(dT) erabiliz25txantiloi/primer gisa.
Kalitate kontrola
1.SDS-PAGE garbitasun elektroforetikoa % 98 baino handiagoa.
2.Anplifikazio-sentsibilitatea, lotez lote kontrola, egonkortasuna.
3.Ez dago nukleasa-jarduera exogenorik, ez endonukleasa exogenorik edo exonukleasa-kutsadurarik
Lehen kate-erreakzioaren soluziorako erreakzioaren konfigurazioa
1.Erreakzio-nahastearen prestaketa
| Osagaiak | Bolumena |
| Oligo(dT)12-18 Primer edo Random Primera Edo Gene Specific Primersb | 50 pmol |
| 50 pmol (20-100 pmol) | |
| 2 pmol | |
| 10 mM dNTP | 1 μL |
| RNA txantiloia | RNA osoa≤ 5μg;mRNA ≤ 1 μg |
| RNasarik gabeko dH2O | 10 μL arte |
Oharrak:a/b: Mesedez, hautatu mota desberdinak zure behar esperimentalen arabera.
2.Berotu 65 °C-tan 5 minutuz eta azkar hoztu izotz gainean 2 minutuz.
3.Gehitu osagai hauek goiko sistemari 20µL-ko bolumen guztira eta nahastu astiro-astiro:
| Osagaiak | Bolumena (μL) |
| 5 × Lehen-Strand Buffer | 4 |
| Neoscript Alderantzizko Transkriptasa (200 U/μL) | 1 |
| RNasaren inhibitzailea (40 U/μL) | 1 |
| RNasarik gabeko dH2O | 20 μL arte |
4. Mesedez, egin erreakzioa baldintza hauen arabera:
(1) Random Primer erabiltzen bada, erreakzioa 25 ℃-tan egin behar da 10 minutuz, eta gero 50 ℃-tan 30 ~ 60 minutuz;
(2) Oligo dT edo lehengai espezifikoak erabiltzen badira, erreakzioa 50 ℃-tan egin behar da 30 ~ 60 minutuz.
5.Berotu 95 ℃-tan 5 minutuz Neoscript Reverse Transcriptase desaktibatzeko eta erreakzioa amaitzeko.
6.Alderantzizko transkripzio produktuak zuzenean erabil daitezke PCR erreakzioan eta fluoreszentzia PCR erreakzio kuantitatiboan, edo -20 ℃-tan gorde daitezke denbora luzez.
PCR Rekintza:
1.Erreakzio-nahastearen prestaketa
| Osagaiak | Kontzentrazioa |
| 10 × PCR Buffer (dNTP gabe, Mg²+ doakoa) | 1× |
| dNTPak (10 mM dNTP bakoitza) | 200 μM |
| 25 mM MgCl2 | 1-4 mM |
| Taq DNA polimerasa (5U/μL) | 2-2,5 U |
| Primer 1 (10 μM) | 0,2-1 μM |
| Primer 2 (10 μM) | 0,2-1 μM |
| Txantiloiaa | ≤% 10 Lehenengo kate-erreakzio-soluzioa (2 μL) |
| ddH2O | 50 μL arte |
Oharrak:a: Lehen kate-erreakzioaren soluzio gehiegi gehitzen bada, PCR erreakzioa inhibitu egin daiteke.
2.PCR Erreakzio Prozedura
| Urratsa | Tenperatura | Denbora | Zikloak |
| Desnaturalizazioaren aurrekoa | 95℃ | 2-5 min | 1 |
| Desnaturalizazioa | 95℃ | 10-20 seg | 30-40 |
| Ontzea | 50-60 ℃ | 10-30 seg | |
| Luzapena | 72 ℃ | 10-60 seg |
Oharrak
1.Alderantzizko transkripzioaren tenperatura optimizatzeko egokia 42 ℃ ~ 55 ℃ tartean.
2.Egonkortasun hobea du, tenperatura altuko alderantzizko transkripzioaren anplifikaziorako egokia da.Horrez gain, RNAren egitura-eskualde konplexuetatik modu eraginkorrean igarotzeko egokia da.Gainera, horiurrats bakarreko fluoreszentzia multiplex RT-PCR detektatzeko egokia da.
3.Bateragarritasun ona PCR anplifikazio-entzimekin eta sentsibilitate handiko RT-PCR erreakzioetarako egokia da.
4.Sentsibilitate handiko urrats bakarreko fluoreszentzia RT-PCR erreakzio kuantitatiborako egokia, txantiloien kontzentrazio baxuaren detekzio-tasa eraginkortasunez hobetzen du.
5.cDNA liburutegiak eraikitzeko egokia.
