5×Neoscript Fast RT-qPCR Premix plus-UNG
Katuaren zenbakia: HCB5142A
Neoscript Fast RT Premix-UNG (Probe qRT-PCR) hodi bakarreko zunda batean oinarritutako nahasketa oso egonkorra da, urrats bakarreko alderantzizko transkripziorako eta PCR kuantitatiborako (qRT-PCR).Primerak eta zundak aurrez nahastea onartzen du eta egonkor mantentzen da denbora luzez tenperatura baxuan gorde ondoren.Probatu beharreko lagina zuzenean gehi daiteke erabiltzean, hodiak irekitzeko/pipetatzeko eragiketa gehigarririk gabe.Produktu honek osagaiak eskaintzen ditu, adibidez, hot-start DNA polimerasa, M-MLV, bero-labileko urazil DNA glikosilasa (TS-UNG), RNasaren inhibitzailea, MgCl2, dNTP (dUTP-ekin ordez dTTP) eta egonkortzaileak.Genetikoki eraldatutako anplifikazio azkarreko alderantzizko transkriptasa eta DNA polimerasarekin, posible da PCR anplifikazioa 20-40 minutuko epean osatzea.Erreaktibo honek qPCRrako buffer berezia erabiltzen du inhibitzaileen aurkako anplifikazio entzimaren eta UNG entzimaren entzimekin.Hori dela eta, xede-geneen anplifikazio ona lor dezake eta PCR hondar eta aerosolen kutsadurak eragindako anplifikazio faltsua saihestu.Erreaktibo hau Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad eta Roche bezalako fabrikatzaileen fluoreszentzia kuantitatiboko PCR tresnekin bateragarria da.
Osagaia
1.25×Neoscript Fast RTase/UNG Mix
2.5×Neoscript Fast RT Premix Buffer (dUTP)
Biltegiratzeko baldintzak
Osagai guztiak -20 ℃-tan mantendu behar dira epe luzerako biltegiratzeko eta 4 ℃ 3 hilabetez.Mesedez, ondo nahastu desizoztu ondoren eta zentrifugatu erabili aurretik.Saihestu maiz izozte-desizoztea.
qRT-PCR Erreakzio Sistemaren Prestaketa
| Osagaiak | 25μLSistema | 50μLSistema | Azken Kontzentrazioa |
| 5×Neoscript Fast RT Premix Buffer (dUTP) | 5μL | 10μL | 1× |
| 25×Neoscript Fast RTase/UNG Mix | 1μL | 2μL | 1× |
| 25×Primer-Probe Mixa | 1μL | 2μL | 1× |
| RNA txantiloiab | – | – | – |
| ddH2O | Gehienez 25μL | Gehienez 50μL | – |
1) a.Primeraren azken kontzentrazioa 0,2μM-koa izan ohi da.Emaitza hobeak lortzeko, lehen kontzentrazioa optimizatu daiteke 0,2-1μM tartean.Orokorrean, zundaren kontzentrazioa 0,1-0,3μM arteko tartean optimizatu daiteke.
2) b.PCR Prozedura azkarra erabiltzean, abiarazleen eta zunden kontzentrazioa handitzeak anplifikazio-emaitza hobeak lor ditzake, eta horien ratioa optimizatu behar da.
3) Lagin mota ezberdinek inhibitzaile mota eta eduki desberdinak dituzte eta xede genearen kopia-kopurua.Laginaren bolumena benetako egoeraren arabera kontuan hartu behar da.Egin laginaren diluzioa nukleasarik gabeko urarekin edo TE Bufferrekin, beharrezkoa bada.
C erreakzioabaldintzak
| PCR prozedura arrunta | PCR Prozedura Azkarra | ||||||
| Prozedura | Tenperatura. | Denbora | Zikloa | Prozedura | Tenperatura. | Denbora | Zikloa |
| Alderantzizko transkripzioa | 50℃ | 10-20min | 1 | Alderantzizko transkripzioa | 50℃ | 5min | 1 |
| Polimerasa Aktibazioa | 95℃ | 1-5 minutu | 1 | Polimerasa Aktibazioa | 95℃ | 30eko hamarkada | 1 |
| Desnaturalizazioa | 95℃ | 10-20 hamarkada | 40-50 | Desnaturalizazioa | 95℃ | 1-3s | 40-50 |
| Ontzea eta Luzapena | 56-64 ℃ | 20-60 hamarkada | Ontzea eta Luzapena | 56-64 ℃ | 3-20s | ||
Kalitate kontrola
1.Funtzioaren detekzioa: qPCRren sentsibilitatea, espezifikotasuna eta errepikakortasuna.
2.Nukleasa-jarduera exogenorik ez: endonukleasa exogenorik eta exonukleasa-kutsadurarik ez.
Oharrak
1.DNA polimerasa azkarraren anplifikazio-tasa ez da 1 kb/10s baino txikiagoa.PCR tresna ezberdinek berotze- eta hozte-abiadura, tenperatura kontrolatzeko moduak eta eroankortasun termikoa dituzte, eta, beraz, ezinbestekoa da zure lehen/zundaren kontzentrazioa eta exekutatzeko metodoa optimizatzea zure PCR tresna azkar espezifikoarekin batera.
2.Produktu honek aplikazio zabala du, eta sentsibilitate handiko diagnostiko molekularrako egokia da.Hiru urratseko PCR metodoa gomendatzen da erretiro-tenperatura baxua duten abiarazteetarako edo 200 bp baino gehiagoko zati luzeak anplifikatzeko.
3.Anplikoi ezberdinek dUTPren erabilera-eraginkortasuna eta UNGarekiko sentsibilitate desberdinak dituztenez, erreaktiboak optimizatu behar dira detekzio-sentsibilitatea gutxitzen bada UNG sistema erabiltzean.Mesedez, jar zaitez gurekin harremanetan laguntza teknikorako behar izanez gero.
4.Eramangarria den PCR produktuen anplifikazioa saihesteko, anplifikaziorako eremu esperimental eta pipeta dedikatu behar dira.Erabili eskularruekin eta aldatu maiz eta ez ireki PCR hodia anplifikazioaren ondoren.
