
N-Glycan Kit
Produktuaren Deskribapena
Dokumentu honek N-Glycan Kit-aren zainketa orokorrari eta erabilerari buruzko informazioa eskaintzen du N-glikanoak askatzeko entzimatiko azkarrak eta etiketatze azkarrak egiteko.Protokolo hau antigorputz monoklonalak erabiliz balioztatzen da eta N-loturiko beste glikoproteina sorta zabal baterako funtzionatzen duela ere probatu da.Erabiltzaileari gomendatzen diogu bere laginaren askapen entzimatikoa berrestea.
Osagaiak
N-Glycan Kit (24T)
Modulua | Coposaketa | HCP0031A |
Desglikosilazio modulua HCP0031A-1 | IgG | 1,2 mg |
PNGase F | 45µl | |
PNGase F buffera | 0,5 ml | |
Surfaktantea | 1,2 mg*6 | |
Etiketatze modulua HCP0031A-2 | MS erreaktibo hautsa | 8,2 mg*3 |
DMF anhidroa | 1 ml | |
Garbiketa Modulua HCP0031A-3 | Eluzio-plaka (96 putzu) | 1 pieza |
Eluzio Buffer | 5 ml* 1 | |
Laginaren diluitzailea | 5 ml* 1 | |
Laginak biltzeko modulua HCP0031A-4 | 8 hodiko zerrendak (200μL) | 100 pieza |
8 txapeleko zerrendak | 100 pieza | |
Bilketa plaka (96 putzu) | 1 pieza | |
Hondakinen erretilua | 1 pieza |
Protokoloa
Erabiltzaileak beheko erreaktiboak eta gailuak prestatu behar ditu hasi aurretik (IgG lagin bat adibide gisa):
(1) %0,85 Nacl, 100µL;azetonitrilo (LC-MS kalifikazioa) ;ur ultrapurua;
(2)15/85=ur ultrapurua/azetonitrilo disoluzioa (v/v), 2mL;1/9/90 = azido formikoa / ur ultrapurua / azetonitrilo (v / v), 20 ml; 50 mM amonio formiatoa, PH = 4,4, 500 ml;
(3) SPE huts-ponpa;presio negatiboko prozesadorea edo presio positiboko prozesadorea;Berokuntza modulua edo metalezko bainua (90 ℃ eta 50 ℃);zurrunbilo nahasgailua;pipeta.
1. urratsa: Desglikosilazio azkarra
(1) IgG lagina % 0,85 Nacl-arekin diluitu IgG azken kontzentrazioa 2 mg/mL-n lortzeko.
(2) PNGase F buffer: diluitu 1 vialeko surfaktante (1.2mg/3.6mg) (24μL/72μL))PNGase F bufferarekin, nahastu eta gorde giro-tenperaturan (soluzio hau erabili aurretik prestatu behar da).
(3) Gehitu 20μL IgG soluzioa 200μL erreakzio-hodiari, gehitu 3μL PNGase F buffer, pipeta gora eta behera nahasteko eta, ondoren, gehitu 3,3μL ur ultrapurua, aspiratu eta banatu nahasteko.
(4) Gehitu goiko soluzio guztia 90 ℃-tan, 3 minutuko berokuntza-moduluari, desnaturalizatu eta gero atera berogailu-modulutik eta hoztu 3 minutuz giro-tenperaturan.
(5) Gehitu 1,2 μL PNGase F, aspiratu eta banatu nahasteko, berotu 50 ℃, 5 minutu berogailu moduluarekin.Erabiltzaileak etiketa-erreaktiboa presta dezake itxaron bitartean.
(6) Atera berogailu modulutik, eta gero hoztu 3 minutuz giro-tenperaturan.
2. urratsa. Glikosilaminen etiketatze azkarra
(1) Etiketatze-erreaktiboaren soluzioa: diluitu ontzi bat etiketatzeko erreaktibo (8,2 mg/24,6 m) DMF anhidroarekin (60, 13 μL/180,4 μL), irtenbide hau erabili aurretik prestatu behar da, aspiratu eta 5-10 aldiz banatu. erreaktiboa guztiz disolbatuta dago.
(2) Gehitu 6μL etiketatze-erreaktibo disoluzioa erreakzio-hodian, aspiratu eta banatu 5-10 aldiz nahasketa ziurtatzeko, eta utzi etiketatze-erreakzioa gelan aurrera egiten.
tenperatura 5 minutuz.
(3) Gehitu 179 μL azetonitrilo, nahastu hurrengo urratserako.
3. urratsa: garbiketa Glycosyla etiketatuameategiak
(1) Konfiguratu presio negatiboko prozesadorea edo presio positiboako prozesadorea eta 96 putzuko eluzio-plaka.
(2) Baldintza-putzuak: gehitu 200μL ur ultrapurua eluzio-plakan putzuak baldintzatzeko, hondakinak bildu hondakinen erretiluan.
(3) Putzuak orekatzeko: gehitu 200μL 15/85 ur/acetonitrilo disoluzioa (v/v) putzuak orekatzeko, bildu hondakinak hondakinen erretiluan.
(4) Kargatu lagina: Kargatu azetonitrilo diluitutako laginak eta bildu hondakinak hondakinen erretiluan.
(5) Garbitu putzuak 600μL 1/9/90 azido formikoarekin/ur ultrapuru/acetonitriloarekin (v/v) bi aldiz eta bildu hondakinak hondakinen erretiluan.
(6) Hondakinen erretilua kendu eta bilketa-plaketara aldatu.
(7) Garbitu zelula 50μL-ko eluzio-buffer batekin, glikanoak atera bilketa-plakan eta errepikatu urrats hau.
(8) Gehitu 200μL lagin diluitzailea, nahastu.
4. urratsa. HILIC-FLR
(1) Kromatografia-zutabea: ACQUITY UPLC® Glycan BEH Amida, 130 Å, 1,7 μm, 2. 1 x 150 mm (urak #186004742 zatia).
(2) Zutabearen tenperatura: 60 °C
(3) A fase likidoa: 50 mM amonio formiato disoluzioa (LC-MS kalifikazioa gomendatzen da), pH = 4,4.
(4) B fase likidoa: %100 azetonitrilo (LC-MS kalifikazioa dagomendatua).
(5) Emaria: 0,4 ml/min;
(6) Gradientea:
Denbora (min) | Emaria (ml/min) | %A | %B | Kurba |
0 | 0.4 | 25 | 75 | 6 |
35 | 0.4 | 46 | 54 | 6 |
36.5 | 0.2 | 100 | 0 | 6 |
39.5 | 0.2 | 100 | 0 | 6 |
43. 1 | 0.2 | 25 | 75 | 6 |
47.6 | 0.4 | 25 | 75 | 6 |
55 | 0.4 | 25 | 75 | 6 |
(7)FLR uhin-luzerak: EX 265/EM 425 nm
(8)FLR laginketa-tasa: 2 Hz
(9)Injekzio bolumena: 10μL
Kontuan izan goiko parametroetan "ACQUITY® RDa" LCMS-rekin hornitutako makinan oinarrituta, erabiltzaileak parametroa beste ekipo batzuetan egokitu dezakeela.
Storage
Erreaktiboa | Biltegiratzea |
IgG | 2-8 ℃, 12 hilabete |
PNGase F | -25 ~ – 15 ℃ ℃, 12 hilabete, saihestu izozteko/desizozteko zikloak |
PNGase F buffera | 2-8 ℃, 12 hilabete |
Surfaktantea | Giro-tenperatura, 12 hilabete |
MS erreaktiboa hautsa | 2-8 ℃, 12 hilabete, mantendu ilunpean |
DMF anhidroa | Giro-tenperatura, 12 hilabete |
Eluzio Buffer | Giro-tenperatura, 12 hilabete |
Laginaren diluitzailea | Giro-tenperatura, 12 hilabete |
96 putzu eluzio-plaka | Giro-tenperatura, ireki ondoren, erabili gabeko putzua plastikozko parafina filmarekin zigilatu behar da eta lehorgailua giro-tenperaturan mantendu behar da. |
200μL 8 hodiko zerrendak, zerrendak 8 txapel, 96 putzu biltzeko plaka, hondakinen erretilua | Giro-tenperatura,96 putzu bilketa plaka zigilatu eta lehorgailua giro-tenperaturan mantendu |
Oharrak
Zure segurtasun eta osasunerako, mesedez, jantzi laborategiko bata eta eskularruak.
Erabili aholku garbiak aldi bakoitzean
Mesedez, jarraitu eskuliburua erreaktiboak gordetzeko eta erabiltzeko